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DDX46基因对结肠癌细胞电离辐射敏感性的影响及机制研究
目的 探讨DDX46基因对结肠癌细胞的电离辐射敏感性的影响及其作用机制.方法 DDX46基因RNA干扰慢病毒转染的SW480细胞为实验组,空载质粒慢病毒转染的SW480细胞为对照组.两组细胞转染72 h后,分别进行0和4 GyX射线照射,采用CCK-8方法检测两组的细胞活力;实验组联合4GyX射线照射24 h后,采用免疫荧光技术和Western blot法检测细胞γ-H2AX foci数量以及DNA损伤修复通路关键蛋白的表达水平,确定DDX46与辐射诱导的DNA损伤修复的关系.结果 4GyX射线照射24 h后,实验组的细胞活力比照射前降低(15.02±3.92)％(t=-4.696,P＜0.05),比对照组降低(17.43±1.83)％(t=4.844,P＜0.01);而对照组照射前后比较差异无统计学意义(P＞0.05).同时,实验组γ-H2AX foci数量相比于对照组增加了(43.03±17.6)％(t=-3.108,P＜0.05),ATM的蛋白水平显著升高(t=7.530,P＜0.01),而ATM的活性形式p-ATM以及ATM的下游靶蛋白Rad50的蛋白水平则明显降低(t=4.260、4.260、P＜0.05),同时γ-H2AX的蛋白表达水平也有一定程度的升高(t=-3.090,P＜0.05),DNA-PK在两组细胞内的蛋白水平变化不大.结论 沉默DDX46可以提高结肠癌细胞系SW480的辐射敏感性,其机制可能是DDX46表达沉默抑制结肠癌细胞系SW480中ATM的活化,从而抑制辐射诱导的DNA损伤的修复,提高SW480的辐射敏感性.
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DDX46调控食管鳞癌TE-11细胞恶性生物学行为的机制探讨
背景与目的:DDX46是一种三磷酸腺苷依赖的RNA解旋酶,在mRNA前体剪接和核糖体组装中发挥核心作用,其在人类肿瘤中的表达及与肿瘤的相关性少见报道.该研究旨在探讨DDX46与食管鳞癌细胞恶性生物学行为之间的关系及可能的调控机制.方法:构建慢病毒载体和shDDX46质粒,转染食管鳞癌TE-11细胞,建立沉默DDX46表达的稳转细胞株,采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定转染效果;采用细胞计数和克隆形成实验检测细胞增殖能力;采用Annexin V-APC单染法流式细胞术检测细胞凋亡情况;采用Western blot检测PI3K-Akt-mTOR信号通路相关分子及自噬相关蛋白的表达水平.结果:慢病毒介导的RNAi有效抑制DDX46在TE-11细胞中的表达(P<0.001).与对照组相比,靶向沉默DDX46基因后细胞计数显示,TE-11细胞生长被显著抑制(P<0.01);克隆形成实验显示,细胞克隆形成能力被显著抑制(P<0.01);流式细胞术凋亡检测显示,细胞凋亡率显著增加(P<0.01);Western blot检测发现,PIK3CG、Akt、P-Akt和mTOR表达水平显著下降(P<0.01),PTEN表达水平无显著变化(P＞0.05),而Beclin 1和LC3表达显著上调(P<0.01).结论:DDX46与食管鳞癌细胞增殖和凋亡相关;沉默DDX46可能通过PI3K-Akt-mTOR信号转导通路,同时激活了细胞凋亡和自噬,进而影响食管鳞癌细胞生长增殖.
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靶向沉默DDX46基因对食管鳞癌TE-1细胞增殖及凋亡的影响
目的 通过shRNA干扰技术,探讨靶向沉默RNA解旋酶DDX46基因对食管鳞癌TE-1细胞增殖及凋亡的影响.方法 以人永生化食管鳞状上皮细胞Het-lA为对照,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测DDX46基因mRNA在TE-1细胞中的相对表达;DDX46基因RNAi靶点序列慢病毒感染的TE-1细胞为实验组,阴性对照序列慢病毒感染的TE-1细胞为对照组,进行细胞计数、克隆形成和细胞凋亡实验;Stress and ApoptosisSignaling Antibody Array Kit检测DDX46基因靶向沉默前后信号通路关键分子的变化.结果 与对照组相比,靶向沉默DDX46基因后细胞计数显示TE-1细胞生长被显著抑制(P＜0.01),克隆形成实验显示细胞克隆形成能力被显著抑制(P＜0.001),Annexin V-APC单染法流式细胞仪凋亡检测显示细胞凋亡显著增加(P＜0.001).PathScan.Antibody Array检测发现Akt(Ser473,phosphorylation)和IκBα (total,N/A)表达水平显著下降(P＜0.01),Caspase-3(Asp175,cleaved)表达水平升高(P＜0.05).结论 DDX46基因在食管鳞癌TE-1细胞中高表达;RNAi靶向沉默DDX46基因可抑制TE-1细胞增殖、诱导细胞凋亡;DDX46基因沉默可能是通过下调Akt/NF-κB信号转导通路,进而发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用.
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解旋酶DDX46 基因对食管鳞癌Eca-109细胞增殖及凋亡的影响
目的:探讨RNA解旋酶DDX46基因对食管鳞癌细胞株Eca-109增殖和凋亡的影响及可能的作用机制.方法:以人永生化食管鳞状上皮细胞Het-1A为对照,实时荧光定量PCR(qPCR)检测DDX46 mRNA在Eca-109细胞中的相对表达水平.应用shRNA干扰技术沉默Eca-109细胞DDX46基因后,分别采用MTT实验、克隆形成实验及流式细胞术检测细胞增殖情况、克隆形成能力以及细胞周期和细胞凋亡情况.并用Western blot检测DDX46基因沉默后Eca-109细胞DDX46蛋白和凋亡信号转导通路关键分子Caspase-3和PARP-1蛋白表达的变化.结果:与Het-1A细胞相比,Eca-109细胞DDX46 mRNA的表达水平显著升高(P<0.01).与对照组相比,靶向沉默DDX46基因后MTT实验显示Eca-109细胞活力明显减弱,增殖能力被显著抑制(P<0.01);克隆形成实验显示Eca-109细胞克隆形成能力被显著抑制(P<0.01);流式细胞术检测显示处于G1期的细胞增加,而处于S期的细胞减少(P<0.05),细胞周期停滞于G0/G1期;凋亡实验显示细胞凋亡率显著增加(P<0.01).Western blot检测显示,与对照组比较,DDX46-shRNA干扰使Eca-109细胞DDX46蛋白表达水平显著下降(P<0.01),而cleaved Caspase-3和cleaved PARP-1蛋白表达水平显著上升(P<0.01).结论:DDX46 mRNA在食管鳞癌Eca-109细胞中高表达,DDX46基因沉默可能通过激活细胞凋亡信号转导通路而发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用.
