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人内皮抑素基因克隆及在大肠杆菌中的表达
目的:获得具有抑制血管内皮细胞生长活性的重组人内皮抑素蛋白.方法:从人胎肝中分离总RNA,经反转录聚合酶链反应(RT-PCR)得到endostatin全基因.用原核细胞表达载体构建了pBV220/endostatin重组质粒,经DNA测序确认后,将其转化大肠杆菌DH5a进行表达、初步纯化及活性测定.结果:经SDS-PAGE电泳分析表达产物分子量约20 Kda,薄层扫描显示表达产物可达细菌总蛋白的30%.结论:经生物学活性测定,表达蛋白能够抑制bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)对牛毛细血管内皮细胞(BCEC)的增殖作用.
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抗血管内皮细胞生长因子受体单抗的制备及鉴定
目的:制备血管内皮细胞生长因子受体(kinase insert domain containing receptor, KDR)的单克隆抗体并鉴定其特异性.方法:在大肠杆菌中表达重组KDR融合蛋白.融合蛋白经凝胶分离纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞,用传统杂交瘤技术与小鼠骨髓瘤细胞融合及次黄嘌呤、氨基喋呤与胸苷选择性培养.单克隆杂交瘤上清经ELISA双筛和S-P免疫组化筛选并鉴定其亚类.结果:经ELISA双筛和组化筛选获得了一株能稳定分泌人KDR单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为SSW2),其分泌抗体亚类为IgG1,产生的腹水效价可达1×10-6.结论:SSW2同血管内皮细胞尤其是肿瘤组织的血管内皮细胞有较强的阳性反应.
关键词： 血管内皮细胞生长因子受体☆ 杂交瘤 抗体 单克隆 内皮生长因子/拮抗剂和抑制剂 -
短肽库中血管内皮细胞生长因子受体Flt-1拮抗剂筛选条件的改进
目的:改进噬菌体肽库的筛选条件,提高筛选阳性率及阳性克隆重复性.使血管内皮细胞生长因子受体Flt-1拮抗剂的筛选更为有效.方法:通过对血管内皮细胞生长因子受体Flt-1的原核表达产物的变性复性处理,获得相对纯化的可溶性Flt-1受体.将该可溶性受体固相化,对噬菌体表达12肽库进行4 ～ 5轮Bio-panning后,挑取单个噬菌斑制备高滴度噬菌体上清.用ELISA法初步鉴定各噬菌体克隆与sFlt-1的特异性结合并测定阳性克隆的DN A 顺序.在Bio-panning过程中增加非特异性蛋白的预吸附,并减少输入噬菌体数量, 再次筛选短肽库.结果:经过第一次筛选,获得了一系列具有一定重复性与同源性的噬菌体克隆. 改进筛选条件后,筛选阳性率由2%提高到8.3%,阳性克隆的重复性也得到显著提高.该高重复阳性克隆的氨基酸顺序与前一次筛选获得的阳性克隆有较高同源性.结论:Bio-panning 条件的改进提高了筛选效率,为不纯蛋白筛选短肽库积累了经验,并为血管内皮细胞生长因子受体拮抗剂的研制奠定了基础.
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玻璃体内注射抗血管内皮生长因子药物在糖尿病性黄斑水肿治疗中的应用
糖尿病性黄斑水肿（D M E ）是由糖尿病引起的黄斑中心区2倍于视盘直径范围内的视网膜增厚、局部的或弥漫性水肿，有或无硬性渗出［1］。其临床表现为视力减退或视物变形或症状不明显，可伴有相对或绝对性中心暗点。未经治疗的1型和2型糖尿病患者在3年内将出现25％～30％的临床显著型黄斑水肿（CSME）。黄斑功能直接影响到患者的视锐度，D M E已成为糖尿病患者视力受损甚至失明的主要原因［2］。DM E的治疗包括黄斑激光光凝术、睫状环玻璃体切割手术、玻璃体注射曲安奈德等，但是这些治疗方法又各自具有局限性。由于血管内皮生长因子（V EG F ）在糖尿病性视网膜病变（DR）及DM E发病中的作用逐渐被重视，因而从抑制VEGF的角度治疗DR、DME的研究近年逐渐兴起［3-5］。现对于常见三种抗VEGF药物进行玻璃体内注射治疗DM E的研究现状作一综述。
