首页 > 文献资料
-
蛋白折叠遗传筛选模型的建立
蛋白折叠即氨基酸序列究竟如何决定蛋白质的高级结构及其功能,是现代分子生物学的一个重要问题.蛋白折叠规律的揭示,对于蛋白质的结构预测、从头设计、结构与功能性基因组的研究等具有重要的意义.大肠杆菌是常用的遗传宿主,因此希望以氯霉素乙酰基转移酶CAT、β-半乳糖苷酶Lac-Z的α片段为报道基因,利用目的蛋白--CAT/α-小片段融合蛋白中目的蛋白的折叠状态与报道基因功能之间的相关性,在大肠杆菌中建立一种简便、通用、快速的遗传筛选模型,对蛋白折叠的遗传学规律问题进行研究.
-
多种细胞因子对转化生长因子β1转录的调控作用
目的:探讨细胞因子TNF-α、IFN-γ、IFN-α、PDGF-BB、bFGF对TGF-β1启动活性的影响.方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增获得含有人TGF-β1基因启动子序列的-1 328～+812 bp片段,与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因构建重组体phTGF2.14, 将其瞬时转染大鼠nFSC细胞,加入细胞因子进行干预,测定CAT活性.结果:10 ng/ml TNF-α可以使重组体的CAT活性升高3.24倍;浓度为1 000 U/ml的IFN-γ、IFN-α使phTGF2.14的CAT活性分别降低至对照的(42±12)%、(58±6)%;浓度为10 ng/ml的PDGF-BB、bFGF对TGF-β1基因启动子的活性没有影响;IFN-γ、IFN-α和TNF-α联合应用TGF-β1基因启动子的活性分别为对照的1.32和1.46倍.结论:TNF-α可促进TGF-β1基因启动子的活性;IFN-γ、IFN-α则对TGF-β1基因启动子的启动活性有抑制作用;IFN-γ、IFN-α可以阻断TNF-α对TGF-β1基因启动子的促进作用;PDGF-BB、bFGF对TGF-β1基因启动子的启动活性无影响,此研究为进一步研究细胞因子在纤维化疾病的相互作用机制提供了依据.
-
重组人TGF-β1对TGF-β1基因启动活性的影响
目的:探讨TGF-β1对人TGF-β1基因自身启动子活性的影响.方法:以人全血基因组DNA为模板,PCR扩增获得TGF-β1基因转录起始位点上游5′端-1 328～+812 bp和+227～+812 bp的片段,以此作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因而不含启动子的pCAT-enhancer质粒构建成重组质粒,并将其转染至大鼠星状细胞株nFSC中,细胞在DMEM培养基中进行培养,用不同浓度的TGF-β1进行干涉,测定并比较细胞的CAT表达水平.结果:不同浓度的TGF-β1对大鼠的肝脏星状细胞的增殖具有抑制作用, 而且这种抑制作用在实验用的浓度范围内具有剂量依赖关系;浓度为2.5 ng/ml TGF-β1可以使转染phTGF0.585、phTGF1.120、phTGF1.423、phTGF1.680、phTGF2.140质粒的大鼠肝星状细胞的CAT活性分别增加2～5倍.结论:TGF-β1在大鼠nFSC细胞中对TGF-β1启动子活性具有自身促进作用,为进一步研究TGF-β1的调节机制提供了依据.
-
报告基因研究及其应用进展
报告基因是现代分子生物学研究领域中用于分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件(如启动子、增强子和沉默子等)和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具,通过它的表达产物便捷、可靠、灵敏地解析基因时空表达调控的内在规律.报告基因技术广泛应用于基因表达调控、信号转导、转基因、启动子分析、受体功能鉴定、基因治疗以及药物筛选等领域,该文将对报告基因的主要类型、特点及其应用研究进展进行综述.
-
锤头状核酶的结构及其对病毒基因表达的抑制
RNA催化的切割反应自1981年〔1〕起陆续有人报告。后来将此类具有催化能力的核糖核酸称为核酶(ribozyrne)，并先后发现了第一型内含子，第二型内含子，RNase P，发卡式核酶(HP)，锤头状核酶(HH)，D型肝炎核酶(斧头状核酶)等种类。 锤头状核酶的结构模型是1987年Symons等〔2〕在研究、比较了多种植物病原体RNA自催化切割反应活性区域的核苷酸序列后提出的。Haseloff等〔3〕在此基础上合成了能有效切割氯霉素乙酰基转移酶(CAT)转录本的锤头状核酶，实现了核酶的人工合成。这为将核酶技术用于抑制和阻断有害基因的表达打下了坚实的理论基础。
-
氯霉素乙酰基转移酶融合蛋白表达、纯化和鉴定
目的对氯霉素乙酰基转移酶(Chloramphenicol acetyltransferase,CAT)基因进行表达和纯化.方法通过PCR扩增编码CAT氨基酸序列的基因片断,并将之克隆入pGEX-2T载体.IPTG诱导蛋白融合表达,产物经琼脂糖亲和层析树脂纯化.免疫印迹鉴定纯化蛋白的抗原性.结果筛选得到的重组子诱导后表达相对分子质量约为52 600的CAT融合蛋白.树脂纯化及酶切后均得到高纯度的蛋白样品.纯化蛋白能与抗CAT抗体特异结合.结论本研究获得了CAT基因的融合表达蛋白,并对其完成纯化,为制备抗血清和抗体打下基础.
