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GPS2基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞的永生化及其增殖凋亡的检测
目的 利用SV40大T抗原(SV40LT)过表达慢病毒建立永生化的GPS2野生与敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)系,并检测GPS2敲除对MEF增殖及凋亡的影响.方法 构建pCDH-Flag-SV40LT-GFP慢病毒表达载体,并进行病毒包装.分离胚胎发育9.5 d(E9.5d)的MEF细胞,感染SV40LT慢病毒,连续传代培养50代以上,把仍存活且状态良好的GFP阳性细胞视作永生化成功的MEF细胞.利用高内涵细胞成像分析仪检测永生化MEF细胞的增殖情况,采用AnnexinV/PI双染色、流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 成功构建pCDH-Flag-SV40LT-GFP慢病毒表达载体,获得滴度为4.03×108 pfu/ml的病毒.分离E9.5d MEF细胞并感染上述病毒,阳性细胞扩大培养并稳定传代50代以上,成功建立了永生化的MEF细胞系.GPS2敲除MEF细胞的增殖能力明显低于野生型,而二者由于血清撤除所引起的凋亡并无明显差异.结论 敲除GPS2抑制MEF细胞的增殖.
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SV40LT基因过表达慢病毒载体的构建与包装
目的 构建SV40LT基因过表达慢病毒载体,并对其进行慢病毒包装,为建立永生化的uncv小鼠胚胎成纤维细胞奠定基础.方法 从293T细胞中获得SV40LT基因,将其克隆到pLenti-GFP质粒中,构建重组穿梭质粒pLenti-GFP-SV40LT,测序鉴定后分别将鉴定的阳性pLenti-GFP-SV40LT和包装质粒pMD2.0G和psPAX2共转染293T细胞,包装产生慢病毒.结果 SV40LT基因过表达慢病毒载体的构建与包装成功.结论 SV40LT基因过表达慢病毒载体构建与包装的成功为uncV小鼠胚胎成纤维细胞的永生化提供了工具.
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SV40LT抗原诱导人源性淋巴细胞恶性转化
目的:研究SV40 Large T(LT)对淋巴细胞转化的影响.方法:将逆转录病毒载体质粒pBabe-SV40LT转入外周血单核细胞.倒置显微镜观察细胞形态变化,蛋白印迹明确LT蛋白表达,流式细胞仪分析膜表面分子的表达,G显代染色体确定核型,生长曲线判别细胞生长状态.软琼脂实验检测细胞恶性变.结果:导入SV40LT后的淋巴细胞形态发生明显改变,由悬浮生长变为贴壁生长.转染细胞中可以检测到LT抗原的表达,有67%细胞表达CD56+分子,核型为异倍体,可在软琼脂上形成细胞集落.结论:用SV40LT转染获得一株可稳定传代且具有CD56+的异倍体恶性淋巴细胞.
