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EOLA1基因小干扰RNA载体构建及其干扰效应检测
目的构建人类新基因内皮高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)特异性的小干扰RNA表达载体,并初步验证其对靶基因的抑制作用.方法构建绿色荧光蛋白(GFP)-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2/EOLA1,并转染人ECV304细胞株,G418压力筛选获得稳定表达株;针对靶基因EOLA1,设计靶点特异性的寡核苷酸,插入pSlincer3.1/H1质粒.转染重组质粒到稳定表达GFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,通过观察转染细胞绿色荧光的强弱和Western blot实验检测靶基因的抑制情况.结果获得了稳定表达GFP-EOLA1融合蛋白的细胞株,构建的小RNA干扰质粒siEOLA1能够抑制靶基因EOLA1的表达.结论成功构建了针对EOLA1基因的siRNA质粒,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.
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内皮活化相关新基因EOLA1的亚细胞定位及组织表达
目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)基因的亚细胞定位和组织表达特性,为对其进行进一步的功能研究打下基础.方法构建EOLA1-EGFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白表达质粒,转染内皮细胞后瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察 EOLA1蛋白的亚细胞定位;通过人多组织Northern杂交研究EOLA1基因的组织表达.结果 EOLA1蛋白在正常人各组织中呈选择性表达,在人的心脏、骨骼肌、肾脏、肝脏和胎盘组织中有较强的表达,在结肠、脾脏和小肠中有较弱的表达,而在脑、胸腺、肺和外周白细胞中无表达;EOLA1蛋白主要定位于细胞浆,少量表达于细胞核.结论 EOLA1属胞内蛋白,可能在细胞内信号转导中起着作用.
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转录因子Sp1在人内皮细胞高表达脂多糖相关因子1基因转录中的作用
目的 明确转录因子Sp1在人内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(endothelial-overexpressed lipopolysiccharide-associated factor 1,EOLA1)基因转录调控中的作用.方法 定点突变EOLA1基因核心启动子- 734～- 666序列中推断的Sp1结合位点,观察启动子活性变化；进行凝胶电泳迁移和染色质免疫共沉淀验证Sp1转录因子与启动子区顺式作用元件发生相互作用.结果 突变Sp1结合位点后,核心启动子的活性(0.12±0.01)较野生启动子(2.51±0.98)显著下降(P＜0.05),EMSA和染色质免疫共沉淀验证了SP1与启动子区顺式作用元件相互作用.结论 转录因子Sp1调控了EOLA1基因的基础转录.
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hEOLA1抗体的制备及肿瘤组织中EOLAl的表达检测
目的 制备抗EOLA1多克隆抗体并检测其在肿瘤组织中的表达.方法 采用原核表达获得EOLA1蛋白,纯化后作为抗原免疫大白兔,获得兔抗人EOLA1(hEOLA1)多抗血清.进行免疫组化检测人多肿瘤芯片上EOLA1的表达.结果 制备了高滴度的hEOLA1多克隆抗体,免疫组化显示EOLA1蛋白在肺癌、结肠癌、胃癌和肝癌仅表达于肿瘤问质.肿瘤细胞本身未见表达,而在胶质瘤和乳腺癌则早广泛表达.结论 EOLA1可能在胶质瘤和乳腺癌的发生、发展方面起着重要作用.
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小干扰RNA表达载体介导的EOLA1基因表达抑制研究
目的设计和构建EOLA1基因特异性的小干扰RNA质粒,并初步验证其对靶基因的抑制作用.方法将靶点特异性的寡核苷酸连接到经ApaⅠ-EcoRⅠ酶切线性化的pBS/U6质粒,测序验证,阳性重组质粒转染ECV304细胞,半定量RT-PCR方法检测靶基因的表达,阳性重组质粒与pEGFP-EOLA1共转染,观察外源报告基因绿色荧光蛋白的表达.结果构建的阳性重组质粒转染能够抑制靶基因EOLA1 mRNA的表达,并能够显著抑制EOLA1-EGFP融合蛋白的表达.结论成功构建了针对EOLA1基因的siRNA质粒,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.
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eola1下调表达对ECV304细胞增殖的影响
目的设计和构建人类新基因人内皮高表达脂多糖相关因子1(endothelium-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor1, eola1)特异性的小干扰RNA表达载体sieola1,建立eola1下调表达模型,观察eola1下调表达对细胞增殖的影响.方法设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamHⅠ-HindⅢ酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上;转染重组质粒到ECV304细胞,通过定量RT-PCR实验检测靶基因的抑制情况;对转染sieola1质粒的细胞进行细胞计数,并应用流式细胞仪观察细胞周期的变化.结果构建的小RNA干扰质粒sieola1转染ECV304细胞能够抑制靶基因eola1的表达;细胞计数和流式细胞仪检测结果显示eola1表达抑制后,细胞生长周期延长.结论成功构建了针对eola1基因的siRNA质粒;细胞计数和流式细胞仪检测结果初步确认eola1具有抑制ECV304细胞增殖的作用.
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人新基因EOLA1生物信息学分析
目的 预测人类新基因EOLA1的生物学功能.方法 基于EOLA1全长cDNA序列,应用生物信息方法 ,从序列比对、染色体定位、基因结构分析、编码蛋白理化性质分析、蛋白质位点和序列模式预测等几个方面对EOLA1进行分析.结果 EOLA1编码的蛋白EOLA1经网上同源性比对没有发现与之高度同源的人类已知蛋白;EOLA1与鼠111002L19蛋白高度同源,到目前为止,对鼠111002L19蛋白功能也不清楚;应用辐射杂交细胞系(RH)作图系统发现EOLA1定位于Xq27.4;对其二级结构进行预测发现在EOLA1蛋白分子中存在酪氨酸激酶Ⅱ和蛋白激酶C磷酸化位点以及1个螺旋-转角-螺旋(HTH)基序.结论 人新基因EOLA1编码蛋白质的一级和二级结构特征赋予EOLA1信号转导能力,有可能作为信号分子在LPS激活人血管内皮细胞的过程中发挥作用.
