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Hath1基因诱导新生大鼠大上皮嵴细胞形成毛细胞样细胞
目的 探讨Hathl(human atonal homolog 1)基因对大鼠耳蜗大上皮嵴(greater epithelialridge,GER)细胞的诱导分化作用.方法 取出牛后1 d大鼠耳蜗,利用酶消化和机械分离相结合的方法分离出GER细胞,并行体外培养.以腺病毒为载体,对GER细胞培养物进行Hath1基因和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因(ad-Hath1-EGFP)的转染,单纯转染EGFP(ad-EGFP)作为对照组,对感染后不同灭数的标本行毛细胞特异性标记物myosin Ⅶa免疫组化染色鉴定.结果 ad-Hathl-EGFP组中的GER细胞中出现了myosin Ⅶa和EGFP双标记细胞,并且从感染后第5天开始出现myosin Ⅶa阳性细胞,随后阳性细胞的数量有所增加,但增加不明显;而ad-EGFP组感染后3～12 d的GER标本均未见myosin Ⅶa阳性细胞.结论 GER细胞可能是耳蜗毛细胞的前体细胞,Hath1基冈过表达可以诱导GER细胞向毛细胞样细胞(myosin Ⅶa阳性)分化.
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人Hath1-cDNA基因的克隆及其真核表达载体的构建
目的 克隆人Hath1-cDNA基因,构建其真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1.方法 从人的全血标本中提取DNA模板,经PCR获得Hath1-cDNA,将Hath1-cDNA和pIRES2-DsRed2质粒用限制性内切酶XhoⅠ、EcoRⅠ双酶切,酶切产物琼脂糖凝胶电泳,割胶纯化,前者回收1065 bp大小片断,后者回收大片断,再将回收的2个片断用T4 DNA连接酶连接,转化DH5α,挑选单克隆,提取质粒,所提质粒进行双酶切鉴定并测序.结果 成功地从人全血中克隆出Hath1-cDNA,并构建了其真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1.结论 pIRES2-DsRed2-Hath1的构建为Hath1基因转染致聋小鼠耳蜗的实验奠定了基础.
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Hath1基因的重组腺病毒转染新生小鼠耳蜗成纤维细胞的初步研究
目的 检测含有人Hath1基因的重组腺病毒Ad-DsRed2-Hath1对新生小鼠耳蜗成纤维细胞的转染情况及Hath1基因在新生小鼠耳蜗成纤维细胞中的表达情况.方法 培养新生小鼠耳蜗成纤维细胞,用含有目的基因Hath1的重组腺病毒Ad-DsRed2-Hath1对其进行转染,转染后24 h通过荧光显微镜观察新生小鼠耳蜗成纤维细胞的转染情况,并通过免疫荧光的方法检测Hath1基因在新生小鼠耳蜗成纤维细胞中的表达情况.结果 含有人Hath1基因的重组腺病毒Ad-DsRed2-Hath1能高效转染新生小鼠耳蜗成纤维细胞,Hath1基因在新生小鼠耳蜗成纤维细胞中能有效表达.结论 含有人Hath1基因的重组腺病毒Ad-DsRed2-Hath1对新生小鼠耳蜗成纤维细胞的高效转染和有效表达为研究Hath1基因转染对正常及致聋小鼠耳蜗效应的实验奠定了基础.
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真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1的构建及其在HEK293T细胞中的表达
目的 构建真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1,并验证其在HEK293T细胞中的表迭.方法 从人的全血标本中提取DNA模板,经PCR获得Hath1-cDNA,将Hath1-cDNA和pIRES2-DsRed2质粒用限制性内切酶XhoⅠ、EcoR Ⅰ双酶切,酶切产物琼脂糖凝胶电泳,割胶纯化,前者回收1065 bp片断,后者回收大片断,再将回收的2个片断用T4DNA连接酶连接,转化感受态DH5α细胞,挑选单克隆,提取质粒,将所提取的质粒双酶切鉴定并测序.再将构建成功的pIRES2-DsRed2-Hath1质粒通过脂质体LipofectamineTM 2000转染HEK293T细胞,观测其转染情况和目的基因的表达情况.结果 成功地构建了真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1,该质粒能有效地转染HEK293T细胞,目的基因能有效表达.结论 pIRES2-DsRed2-Hath1的构建为Hath1基因转染致聋小鼠的耳蜗的实验奠定了基础.
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非小细胞肺癌中Hath1、p27和Cyclin D1的表达及临床意义
目的 检测Hath1、 细胞激酶抑制物p27和细胞周期素D1(Cyclin D1)在非小细胞肺癌组织中的表达,分析其相互关系及其与临床病理参数的关系,了解其在非小细胞肺癌发生、 发展中的作用.方法 采用免疫组织化学法和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分别从蛋白和mRNA的水平检测非小细胞肺癌组织和癌旁组织中Hath1、p27和Cyclin D1的表达水平,并结合收集的临床病理资料如病理分型、 分化程度和淋巴结转移情况进行分析.结果 Hath1、p27在非小细胞肺癌组织中的阳性表达低于癌旁组织,Cyclin D1在非小细胞肺癌组织中的阳性表达高于癌旁组织(P均<0.05).三者的表达均与肿瘤分化程度和淋巴结转移有关.Hath1在蛋白和基因水平的表达与p27呈明显正相关(P<0.05),与Cyclin D1呈明显负相关(P<0.05);而p27在蛋白和基因水平的表达与Cyclin D1呈明显负相关(P<0.05).结论 Hath1、p27和Cyclin D1可能参与了非小细胞肺癌的分化、 侵袭转移等生物学行为,可作为判断非小细胞肺癌的生物学指标.Hath1、p27和Cyclin D1存在相关性,但具体作用机制还有待进一步研究.
