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CRKL、PgP不同表达情况与白血病细胞耐药关系的临床研究
目的探讨CRKL高表达与白血病细胞多药耐药的关系和在耐药中的作用，为临床观察和判定预后提供新的参考依据和指标。方法应用免疫组化技术对59例急性髓系白血病患者骨髓PgP、CRKL表达情况进行检测。利用MTT技术体外观察两种蛋白表达对柔红霉素的敏感性。结果根据CRKL、PgP的表达，有4种情况：（1）两者均表达即双阳性CRKL＋/PgP＋，共17例；（2） CRKL＋/PgP-，共13例；（3） CRKL-/PgP＋，共18例；（4）两者均不表达即双阴性CRKL-/PgP-，共11例。 CRKL、PgP表达与DNR对细胞抑制率的关系结果表明CRKL-/PgP＋组与CRKL-/PgP-组比较，P＜0.01；CRKL＋/PgP-组与CRKL-/PgP-组比较，P＜0.01；CRKL＋/PgP-组与CRKL-/PgP＋组比较，P＞0.05，CRKL＋/PgP-组与CRKL＋/PgP＋组比较，P＜0.01；CRKL-/PgP＋与CRKL＋/PgP＋组比较，P＜0.01。结论当两种蛋白表达均为阴性时，肿瘤细胞对化疗药物（柔红霉素）敏感性高；而两者之一表达时肿瘤细胞均出现一定程度的耐药；当两者同时阳性时肿瘤细胞的耐药性明显增强，说明当两者同时表达时肿瘤细胞可以出现耐药的叠加作用。
关键词： 白血病 多药耐药相关蛋白质类 CRKL Pgp -
MiR-429通过CRKL靶向作用对U87胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响
目的 研究miR-429对人U87胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响及可能机制.方法 培养人U87胶质瘤细胞,应用Lipofectamine(R) LTX试剂将pre-miR-429质粒载体以及anti-miR-429质粒载体分别稳定转染人U87胶质瘤细胞;应用Real-time-PCR验证转染效率;应用CCK-8试剂盒检测miR-429对人U87胶质瘤细胞增殖能力的影响;应用Real-time PCR和Western blot检测人U87胶质瘤细胞中接头蛋白CRKL(v-crk avian sarcoma virus CT10 oncogene homolog-like,CRKL)的mRNA和蛋白表达含量变化;将CRKL分别转染至U87胶质瘤细胞和miR-429过表达的U87胶质瘤细胞,应用CCK-8试剂盒检测人U87胶质瘤细胞增殖,应用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化,应用Western blot法检测凋亡相关蛋白caspase-3和Bcl-2的蛋白表达变化. 结果 与对照组相比,miR-429过表达显著抑制了人U87胶质瘤细胞增殖,明显诱导了凋亡发生,显著降低了CRKLmRNA和蛋白在人U87胶质瘤细胞的表达水平,caspase-3的表达水平显著上调,Bcl-2的表达水平显著降低.CRK过表达显著增强了人U87胶质瘤细胞增殖能力并且抑制了细胞凋亡,caspase-3的表达水平显著下调,Bcl-2的表达水平显著增强;CRKL过表达有效阻断了miR-429上调caspase-3、降低Bd-2的作用,有效阻断了miR-429抑制U87胶质瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用.结论 MiR-429抑制CRKL从而降低人U87胶质瘤细胞的增殖能力,诱导细胞凋亡.
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miR-761通过靶向作用CRKL抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖研究
目的 探讨miR-761对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响以及相关机制.方法 采用Lipofectamine 2000将miR-761过表达和沉默质粒载体分别转染卵巢癌SKOV3细胞后,采用Real-Time PCR验证其转染效率;采用CCK8法检测miR-761对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响;采用Real-Time PCR检测卵巢癌SKOV3细胞中CRKL mRNA表达变化.采用双荧光素酶报告基因验证miR-761和CRKL的存在靶向结合并明确其结合位点.将CRKL(+)和CRKL(-)慢病毒载体分别转染至卵巢癌SKOV3细胞;采用CCK8法检测CRKL对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响.将CRKL(+)和CRKL(-)质粒分别转染至已经建立的miR-761过表达和沉默细胞,采用CCK8检测卵巢癌SKOV3细胞增殖变化.结果 与对照组比较,miR-761过表达显著抑制了卵巢癌SKOV3细胞的增殖,极大降低了CRKL在SKOV3细胞中的mRNA和蛋白水平;miR-761和CRKL存在靶向结合,并明确了其结合位点;CRKL过表达显著增强了卵巢癌SKOV3细胞增殖能力;CRKL过表达有效阻断了miR-761抑制SKOV3细胞增殖的作用.结论 miR-761能够通过靶向下调CRKL,抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖.
关键词： miR-761 CRKL 增殖 卵巢癌SKOV3细胞 -
miR-429对CRKL表达的靶向调控作用研究
目的 探讨miR-429对CRKL的靶向调控作用.方法 构建双荧光素野生型psiCHECK-2-CRKL-3'-UTR-WT及突变型psiCHECK-2-CRKL-3'-UTR-MUT重组表达载体,双荧光素酶报告实验检测miR-429与CRKL-3'-UTR的靶向结合;瞬时转染miR-429模拟物及其抑制剂,qRT-PCR和Westernblot检测miR-429对内源性CRKL表达水平变化的影响;qRT-PCR检测CRKL上、下调对内源性miR-429表达水平变化的影响.结果 双荧光素报告实验结果表明miR-429直接靶向CRKL-3'-UTR第2个结合位点;同时与HepG2-miR-NC相比,miR-429上调使内源性CRKL蛋白下调了(55.0±1.5)％(P =0.0089),与HepG2-LNA-miR-429相比,miR-429下调使内源性CRKL蛋白上调了(44.3±1.0)％(P =0.0038),差异具有统计学意义,而miR-429上、下调对内源性CRKL mRNA表达变化无影响;且与HepG2-shNC相比,CRKL下调使内源性miR-429表达上调了(102.8±20.0)％(P =0.0069),与HepG2-PCDH相比,CRKL上调使内源性miR-429表达下调了(92.4±3.2)％(P =0.0009),差异具有统计学意义.结论 miR-429靶向作用于CRKL-3'-UTR在转录后蛋白翻译水平负性调控CRKL表达,同时CRKL负性调控内源性miR-429的表达.
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沉默CrkL对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和生存力的影响及其机制
目的 探讨沉默CrkL对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和生存力的影响及其机制.方法 分别用空白试剂、阴性慢病毒和CrkL RNAi慢病毒(沉默CrkL mRNA)感染H9C2心肌细胞,并进行缺氧/复氧(H/R)干预.实验分为空白组、阴性病毒组、CrkL沉默组、空白+H/R组、阴性病毒+H/R组、CrkL沉默+H/R组.用RT-PCR法检测心肌细胞CrkL mR-NA的表达,蛋白印迹分析法检测心肌细胞CrkL蛋白、p-ERK1/2蛋白表达,MTT法检测细胞的增殖率,流式细胞术检测细胞的凋亡率.结果 CrkL沉默组较空白组和阴性病毒组,CrkL沉默+H/R组较空白+H/R组和阴性病毒+H/R组CrkLmRNA、CrkL蛋白、p-ERK1/2蛋白、细胞增殖率均降低(P＜0.05或P＜0.01),细胞凋亡率均增加(P＜0.01).结论 沉默CrkL能加重缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和生存力降低.该过程可能是由p-ERK1/2蛋白表达降低介导的.
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miR-126对 Hela细胞增殖的影响及其与 CRKL 的靶向关系
目的：探讨miR-126对宫颈癌Hela细胞增殖活性的影响及其与CRKL的靶向关系。方法：构建miR-126、CRKL野生型（CRKL-WT）和突变型（CRKL-MT）真核表达载体pcDNATM6．2-GW-pre-miR-126、pmirGLO-CRKL-WT和pmirGLO-CRKL-MT。采用实时荧光定量PCR法检测未转染、pcDNATM6．2-GW转染和pcDNATM6．2-GW-pre-miR-126转染Hela细胞miR-126和CRKL mRNA的表达水平，应用MTT法检测细胞的增殖活性，Western blot法检测细胞CRKL蛋白的表达水平。将细胞分别共转染pcDNATM6．2-GW和pmirGLO-CRKL-WT、pcDNATM6．2-GW和 pmirGLO-CRKL-MT、pcDNATM6．2-GW-pre-miR-126和 pmirGLO-CRKL-WT、pcDNATM6．2-GW-pre-miR-126和pmirGLO-CRKL-MT，采用双荧光素酶报告系统检测细胞荧光素酶活性。结果：与pcDNATM6．2-GW转染组细胞比较，pcDNATM6．2-GW-pre-miR-126组细胞miR-126 mRNA过表达（t＝545．891，P＜0．05），CRKL mRNA和蛋白表达水平均降低（t＝135．755、180．661，P＜0．05），同时细胞的增殖活性亦降低（P＜0．05）；共转染pcDNATM6．2-GW-pre-miR-126和pmirGLO-CRKL-WT 的 Hela 细胞荧光素酶活性下调（ Fpre-miR-126＝55．627， FCRKL ＝61．843， F交互＝76.203，P均＜0．001）。结论：miR-126的过表达能够显著抑制Hela细胞的增殖，并且与CRKL具有良好的靶向关系。
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接合物蛋白Crk与CrkL在卵巢癌细胞株MCAS细胞增殖中的不同作用
目的 探讨接合物蛋白Crk和CrkL在卵巢癌细胞株MCAS细胞增殖中的不同作用.方法 采用免疫共沉淀法检测上皮性卵巢癌细胞株MACS中Crk和CrkL蛋白与已知的与肿瘤增殖相关的上下游结合蛋白的内源性结合；用可调节性siRNA敲低MACS细胞中内源性的Crk及CrkL,观察二者对细胞生长及存活能力的影响.结果 免疫共沉淀显示卵巢癌细胞株MACS中,Crk与影响细胞生长增殖的上游蛋白p130Cas及下游蛋白Sos的结合明显强于CrkL,尽管Crk与CrkL表现出部分相同的免疫原性.免疫印迹显示在加入Dox后即Crk或CrkL表达沉默被启动.Crki/CrkLi细胞中加入Dox后Crk与CrkL表达明显降低[Dox+:Crk(0.021±0.001),CrkL(0.676±0.005)；Dox -:Crk (0.544±0.003),CrkL (1.282±0.007),P＜0.05].对可调节性siRNA构建之可控性Crki/CrkLi细胞的连续动态观察发现,Crki细胞表现出细胞增殖力受限仍保存生存活力,而CrkLi细胞则表现出逐渐脱壁至死亡.结论 Crk及CrkL在卵巢癌细胞MCAS的恶性增殖中扮演着不同的作用,Crk蛋白的过度表达可能直接影响着卵巢癌细胞恶性增殖,而CrkL则可能更多地参与了细胞基本生存相关的生物行为.
关键词： Crk CRKL 接合物蛋白 卵巢癌细胞株MCAS
