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不同年龄人群血清不定型流感嗜血杆菌外膜蛋白 P6及其 T-B 联合表位肽抗体水平
目的：研究不同年龄人群血清不定型流感嗜血杆菌（ nontypeable Haemophilus influen-za， NTHi）外膜蛋白P6及其T-B联合表位肽抗体水平，为NTHi 外膜蛋白P6多抗原肽疫苗的研究提供科学依据。方法构建NTHi P6原核表达系统，纯化重组蛋白P6，同时采用Epitope prediction 1．0软件和ANTIGENIC程序预测NTHi P6的T表位和B表位，合成T-B联合表位肽。以P6及其T-B联合表位肽为抗原，采用ELISA法检测血清中相应抗体水平。研究对象为605例来我院体检者，年龄范围为1天～103岁，组间抗体水平比较采用Mann-Whitney U检验，相关性采用Pearson相关分析法。结果研究中预测到NTHi P6的T-B联合表位肽有4条，分别是P6-2、P6-61、P6-95和P6-122。＜1个月组血清NTHi P6及其上述表位肽抗体水平均显著低于1～6个月组（ P均＜0．001）和7个月～3岁组（P均＜0．001）。7个月～3岁组 P6及其各表位肽抗体水平高，显著高于4～6岁组（P 均＜0．01），4～6岁组又显著高于7～14岁组（P均＜0．01），其他各相邻年龄组间5种抗体差异较小。血清表位肽P6-2、P6-61、P6-95和P6-122抗体水平与P6抗体水平均显著相关（ P＜0．0001）。结论本研究预测的NTHi P6的T-B联合表位肽与P6在人血清中的抗体分布高度一致，提示其具有良好的免疫原性；7个月～3岁组儿童血清中P6及其表位肽抗体水平高，可能与该年龄段NTHi感染率高有关。
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不可分型流感嗜血杆菌P6重组蛋白的原核表达及其黏膜免疫效应
目的:研究不可分型流感嗜血杆菌重组P6蛋白的免疫原性,以确定重组P6蛋白在不可分型流感嗜血杆菌疫苗研制中的应用价值.方法:扩增P6目的基因,构建重组质粒PGEX-6P2/P6,鉴定后将其转化入E.coli XL1-Blue,IPTG诱导、纯化后经SDS-PAGE、Western blot分析;纯化的重组蛋白经滴鼻方式免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清IgG,肺灌洗液IgA的水平及脾细胞中IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ的产生水平.CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖情况.结果:成功构建了重组表达载体PGEX-6P2/P6,并表达GST-P6融合蛋白.Western blot证明GST-P6蛋白能与菌源P6蛋白免疫小鼠后的抗血清发生特异性反应.动物实验表明重组P6蛋白通过滴鼻途径既能刺激小鼠产生血清IgG,又能诱导肺黏膜产生较高的特异性IgA抗体.重组蛋白+ IL-2组小鼠脾淋巴细胞所产生的IL-17和IFN-γ的含量高于对照组(P＜0.05).结论:P6蛋白的原核表达载体PGEX-6P2/P6在大肠杆菌XL1-Blue中大量表达,重组P6蛋白经黏膜免疫可以同时诱导产生体液免疫和细胞免疫.此实验为P6蛋白疫苗的研发提供了理论基础.
关键词： 不可分型流感嗜血杆菌 外膜蛋白P6 原核表达 黏膜免疫效应 -
MDC对不可分型流感嗜血杆菌P6重组蛋白免疫原性的影响
观察巨噬细胞源趋化因子(macrophage-derived chemokine,MDC)联合不可分型流感嗜血杆菌重组P6蛋白免疫小鼠的免疫效果,探讨MDC的佐剂效应.将50只BALB/c小鼠随机分为5组:P6重组蛋白+MDC,P6重组蛋白,MDC组,P6重组蛋白+IL-2组及PBS对照组,分别于第0d、14d、28 d经腹腔免疫3次,末次免疫后14 d,取小鼠血、脾标本,ELISA法检测血清中抗体IgG水平,并分析其脾淋巴细胞IL-10和IFN-γ的产生水平.CCK-8法检测各组脾淋巴细胞增殖活性.结果是小鼠血清IgG水平,P6重组蛋白联合MDC组高于PBS对照组、MDC组、P6重组蛋白+IL-2组及P6重组蛋白组(P＜0.05).P6重组蛋白联合MDC组小鼠特异性脾淋巴细胞刺激指数及其所产生的IL-10、IFN-γ水平均高于PBS对照组、MDC组及P6重组蛋白组(P＜0.05).因此MDC联合P6重组蛋白诱导小鼠的免疫应答优于P6重组蛋白单独免疫,MDC可以作为不可分型流感嗜血杆菌P6重组蛋白的佐剂.
关键词： 不可分型流感嗜血杆菌 外膜蛋白P6 巨噬细胞源趋化因子(MDC) 佐剂 -
不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6基因真核质粒的构建及表达
目的:构建不可分型流感嗜血杆菌(nontypeable Haemophilus influenzae,NTHi)外膜蛋白P6(outer membrane protein P6,P6)真核表达的重组质粒,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的开发奠定基础.方法:以NTHi基因组为模板,扩增编码P6蛋白的基因片段,酶切、纯化P6基因与真核载体pcDNA3.1/HisA后进行连接,之后转化并筛选含有目的基因的重组质粒pcDNA3.1/HisA-P6;将重组子转染至HeLa细胞,荧光蛋白法检测其表达产物.结果:经质粒PCR、酶切、测序证实插入的基因片段为NTHi-P6蛋白编码基因;荧光显微镜下显示,该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白.结论:成功地构建了真核重组质粒pcDNA3.1/HisA-P6,并在HeLa细胞中表达.
关键词： 不可分型流感嗜血杆菌 外膜蛋白P6 核酸疫苗 真核表达质粒 -
不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6基因真核质粒的保护性研究
目的:探讨不可分型流感嗜血杆茵(nontypeable Haemophilus influenzae,NTHi)外膜蛋白P6(outer membrane protein P6,P6)真核质粒的免疫保护性及其可能的保护机制.方法:构建pcDNA3.1/HisA-P6核酸疫苗,转染HeLa细胞;将P6质粒免疫BALB/c小鼠后,ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞IFN-γ和IL-4产生水平:CCK-8法分析脾淋巴细胞增殖情况,并建立小鼠NTHi感染模型,检测小鼠鼻咽部灌洗液NTHi数目变化:HE染色法分析鼻黏膜病理变化.结果:pcDNA3.1/HisA-P6在HeLa细胞中有目的蛋白的表达,免疫后pcDNA3.1/HisA-P6组小鼠脾淋巴细胞产生的IFN-γ及刺激指数均高于pcDNA3.1/HisA、PBS对照组(P<0.05).而IL-4的表达无差异;P6组鼻咽部NTHi清除率也显著高于对照组(P<0.01);病理显示P6组小鼠鼻黏膜组织结构基本正常,而时照组鼻黏膜紊乱、脱落.讨论:P6核酸疫苗可诱导小鼠产生明显的抗NTHi保护效应,其可能的保护机制包括细胞免疫、体液免疫及黏膜免疫.
关键词： 不可分型流感嗜血杆菌 外膜蛋白P6 核酸疫苗 保护性免疫 -
IL-2联合不可分型流感嗜血杆菌P6重组蛋白对小鼠免疫功能的影响
目的 观察IL-2联合不可分型流感嗜血杆菌重组P6蛋白免疫小鼠的免疫效果,探讨IL-2的佐剂效应.方法 将50只Balb/c小鼠随机分为5组:P6重组蛋白组、P6重组蛋白+IL-2组、IL-2组、P6重组蛋白+弗氏佐剂组及PBS对照组,分别于第0、14、28天经腹腔进行3次免疫,末次免疫后14d,取小鼠血、脾标本,ELISA法检测血清中抗体IgG水平,并分析其脾淋巴细胞IL-4、IL-10、IL-2和IFN-γ的产生水平.CCK-8法检测各组脾淋巴细胞增殖活性.结果 P6重组蛋白联合IL-2组通过腹腔免疫刺激小鼠产生的血清IgG水平,高于PBS对照组、P6重组蛋白组及IL-2组(P＜0.05).P6重组蛋白联合IL-2组小鼠特异性脾淋巴细胞刺激指数及其所产生的IFN-γ、IL-2水平均高于PBS对照组、P6重组蛋白组及IL-2组(P＜0.05),而IL-4、IL-10水平各组无差异.各项检测中P6重组蛋白联合IL-2组与P6重组蛋白联合弗氏佐剂组无显著性差异(P＞0.05).结论 IL-2联合P6重组蛋白诱导小鼠的免疫应答优于P6重组蛋白单独免疫,IL-2可以作为不可分型流感嗜血杆菌P6重组蛋白的佐剂.
关键词： 不可分型流感嗜血杆菌 外膜蛋白P6 白细胞介素-2 佐剂 -
抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6单克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的单克隆抗体(mAb)并进行鉴定.方法 以重组P6蛋白腹腔免疫BALB/c小鼠,常规细胞融合技术制备杂交瘤细胞株;间接ELISA筛选阳性细胞克隆并检测染色体数目;测定细胞培养上清的mAb效价及特异性,鉴定mAb的免疫球蛋白类、亚类及抗原结合表位.结果 获得2株抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的杂交瘤细胞株α2G3和γ2C4,染色体众数分别为103与95;间接ELISA结果证明细胞培养上清高效价分别为1∶256和1∶512,未出现与其他种类细菌的交叉反应;α2G3为IgG2b、γ2C4为IgM,均为κ型;两者可能识别P6蛋白不同表位.结论 成功制备了抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的mAb.
