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诺如病毒衣壳蛋白重组人3型腺病毒的构建
目的 制备表达诺如病毒衣壳蛋白的重组人3型腺病毒.方法 将诺如病毒衣壳蛋白基因(Noro-orf2)克隆到腺病毒穿梭载体pBSE3CMV-egfp上,与线性化人3型腺病毒骨架质粒pBRAdv3共电转化感受态大肠杆菌BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,带Noro-orf2基因的表达框置换腺病毒E3区,PCR及酶切筛选得到重组腺病毒质粒,将重组腺病毒质粒转染Hep-2细胞进行包装,获得感染性的重组腺病毒粒子,免疫组化分析重组腺病毒中诺如病毒衣壳蛋白的表达.结果 同源重组后经酶切和PCR鉴定证明插入Noro-orf2基因的重组腺病毒质粒pBRAdv3E3dNor成功构建,并经转染包装得到高滴度的重组腺病毒Adv3E3dNor,免疫组化证明诺如病毒衣壳蛋白得到表达.结论 成功构建表达诺如病毒衣壳蛋白的重组3型腺病毒Adv3E3dNor,为研制人3型腺病毒-诺如病毒双价疫苗奠定了基础.
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人3型腺病毒衣壳六邻体嵌合乙肝病毒preS1双抗原表位重组体的构建及其抗原性的初步鉴定
目的：通过构建在六邻体中嵌合表达乙肝病毒表面抗原preS1上两个中和抗原表位的人3型重组腺病毒，鉴定应用此策略所展示表位的抗原性。方法利用overlap PCR技术扩增出在HVR1和HVR2中分别引入乙肝病毒表面抗原中和表位KR359和KR127的嵌合六邻体基因，酶切后连接入穿梭质粒pBR322-L/R，然后与骨架质粒pBRAdΔE3GFP共转化至BJ5183中重组，得到阳性克隆pBRAdΔE3GFP-preS1。将其线性化后转染293细胞拯救病毒，再大量扩增并纯化。同时应用表达载体pGEX-4T3表达融合蛋白GST-KR359KR127，将重组病毒和GST融合蛋白分别免疫BALB/c小鼠获得多抗血清。 ELISA、Western blot实验鉴定嵌合表位的抗原特性。结果人3型腺病毒载体成功的在衣壳六邻体表面展示了乙肝病毒表面抗原中和表位KR359和KR127，并且诱导产生的多抗血清能识别GST融合表达抗原以及天然的乙肝病毒表面抗原。结论衣壳融合策略置换高变区来展示外源中和表位的方法可行，并且可以通过同时置换多个高变区来达到加强免疫效果或者多价抗原免疫保护的作用，为人3型腺病毒六邻体嵌合载体系统在疫苗研究中的应用奠定基础，同时也为新型乙肝疫苗的研制奠定基础。
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人3型腺病毒快速实验室检测方法的建立
[目的]为不明原因的呼吸道感染疾病的诊断提供一个新的筛选检测方法. [方法]建立一套针对人Ad3型腺病毒的PCR检测方法并应用该方法对人Ad3型腺病毒进行灵敏度、特异性的试验. [结果]通过对提取的Ad3型腺病毒DNA定量测定,该建立的方法可检测到pg级的人Ad3型腺病毒DNA,PCR扩增产物为一条特异的502 bp条带. [结论]建立的快速检测人Ad3型腺病毒的方法大大改善了用细胞培养的不便,不仅缩短了检测时间,而且提高了检测的灵敏度.
关键词： 人3型腺病毒 多聚酶链反应(PCR) 检测 -
人3型腺病毒纤突的原核表达及其免疫原性分析
目的：克隆表达人3型腺病毒（HAdV-3）的纤毛蛋白纤突片段（knob），分析其免疫原性，为腺病毒临床诊断试剂及新型疫苗的研发奠定基础。方法 PCR扩增knob基因片段，克隆到表达载体pGEX-4T-3中进行诱导表达，SDS-PAGE电泳分析表达产物，包涵体溶解复性后亲和层析纯化融合蛋白，Western blot鉴定，纯化的蛋白免疫小鼠制备抗血清，间接ELISA法检测小鼠血清的效价，Western blot鉴定抗血清特异性。结果成功构建了重组原核表达质粒pGEX-Ad3 knob，其在大肠杆菌中高效表达并纯化重组knob融合蛋白，融合蛋白免疫小鼠抗血清效价高达107， Western Blot证实此抗血清可识别人3型腺病毒纤维蛋白。结论成功获得了重组HAdV-3 knob蛋白，其具有强免疫原性，可以作为研发人3型腺病毒入侵机制研究、诊断试剂及疫苗研发的原料。
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人3型腺病毒GZ13株的分离鉴定及六邻体蛋白的分子进化研究
目的 分离鉴定1株引起儿童急性支气管肺炎的腺病毒及分析其主要中和抗原六邻体蛋白的分子进化趋势.方法 采用荧光定量PCR方法,对1例引起严重支气管肺炎的患儿咽拭子进行检测,并从中分离得到1株腺病毒(命名为GZ13).利用型特异性引物PCR进行初步亚型鉴定;克隆该株腺病毒完整的六邻体蛋白基因,测序和序列比对,确定其型别;同时与GenBank上人3型腺病毒的六邻体蛋白进行同源性比对,分析预测六邻体蛋白的分子进化趋势.结果 该临床标本经荧光定量PCR鉴定为腺病毒强阳性,型特异性引物PCR初步鉴定为3型;完整六邻体基因比对终确定为人3型腺病毒;GZ13株与我们先前分离的GZ01、GZ02株及台湾地区分离株核苷酸及氨基酸的同源性均大于99%.结论 引起该例儿童急性支气管肺炎的病原体为人3型腺病毒,目前在广州以及台湾地区流行的3型腺病毒仍属同一流行株,其主要中和性抗原六邻体蛋白未出现明显变异,这对今后开发研究人3型腺病毒疫苗及药物具有重要指导意义.
