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抗人禽流感病毒H5N1人源化单链抗体噬菌体文库的构建和筛选
目的 利用抗人禽流感病毒H5N1 IgG抗体阳性的人禽流感康复患者外周血淋巴细胞,构建人源化Fv段单链抗体(seFv)噬菌体文库,并筛选与禽流感病毒相关蛋白有结合活性的scFv抗体文库.方法 提取人外周血淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA,以其为模板,利用家族特异性IgG基因的引物,扩增重链和轻链的可变区基因,并用合成的连接子将轻链和重链基因连接成单链抗体片段后,重组到噬菌粒载体pCANTAB5E中.将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌TG1,酶切和PCR鉴定抗体库的重组率,通过测定噬菌体抗体库的滴度计算抗体库的库容,用特异性禽流感病毒相关蛋白筛选表达的单链抗体.结果 构建了源于人禽流感康复患者血清的scFv抗体文库,库容为3.75×104;筛选出与禽流感病毒相关蛋白有结合活性的scFv抗体文库.结论 成功构建了抗人禽流感病毒H5N1的人源scFv噬菌体抗体库,并筛选出特异性结合人禽流感病毒相关蛋白的单链抗体,为进一步制备快速检测试剂和治疗研究提供了基础数据.
关键词： 人禽流感病毒H5N1 人源化单链抗体 噬菌体文库 构建 筛选 -
人源化抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa抗体库的构建及临床价值
目的筛选出抑制血小板聚集的血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa自身抗体, 用噬菌体表面展示技术构建人源化抗血小板GPⅡb/Ⅲa单链噬菌体抗体(ScFv)库.方法用单克隆抗体特异性俘获血小板抗原(MAIPA)技术和血小板聚集试验筛选出血浆中含有抑制血小板聚集的血小板GPⅡb/Ⅲa自身抗体的特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者.从筛选出患者的外周血淋巴细胞中提取mRNA,用RT-PCR扩增出人免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片断,用DNA linker将VH和VL连接成ScFv基因片断.用限制性内切酶SfiⅠ/NotⅠ酶切ScFv后克隆到噬菌体载体pHEN2,然后转化大肠杆菌TG1.用辅助噬菌体M13 K07援救转化后的TG1,产生ScFv.结果 95例慢性ITP患者中 41例(43.2%)血浆中抗GPⅡb/Ⅲa自身抗体阳性,强阳性患者5例(5.3%).2例(2.1%)明显抑制血小板聚集功能.扩增出380～400 bp大小的VH和VL基因,用连接肽(Gly4Ser)3成功地连接成约780 bp大小的ScFv片断.ScFv克隆到pHEN2并转化大肠杆菌TG1后,形成2.1×107个克隆.用辅助噬菌体M13K07援救TG1后产生的噬菌体抗体库滴度为1.62×1010cfu/ml.结论少数抗GPⅡb/Ⅲa自身抗体可抑制血小板聚集功能.用噬菌体表面展示技术构建了ScFv库,可用来筛选人源化抗血小板GPⅡb/Ⅲa ScFv.
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抗VSTM1-v2细胞因子人源化单链抗体文库的构建及筛选
本文将鼠源VH-CDR3库(library of murine VH-CDR3)移植到特定的人源scFv (single-chain antibodyfragment) VH3-VK1框架构建人源化scFv文库,快速筛选抗VSTM 1-v2的人源化单链抗体.以抗VSTM1-v2鼠源eDNA为模板,扩增出鼠源VH-CDR3库,随后将鼠源VH-CDR3库移植到人源scFv (VH3-VK1)上并通过核糖体展示富集抗VSTM1-v2人源化scFv文库,该文库序列通过与原核基因表达调控等成分(N端添加T7启动子、SD序列和PelB序列、C端添加his标签序列和T7 terminal序列)拼接,构建表达型TA载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)进行可溶性表达.终构建了一个库容达1012的人源化单链抗体文库,完成了1 000个克隆的初步鉴定,并筛选出EC50达21.35 nmol·L-1的抗VSTM 1-v2人源化scFv.该研究结果,一方面获得了具有潜在应用价值的抗-VSTM1-v2先导抗体；另一方面,为快速获得人源化抗体提供了一个新技术途径.
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人源化抗血小板膜糖蛋白Ⅵ单链抗体的研究
,形成4.1×107个克隆.用辅助噬菌体M13K07援救TG1后产生的抗体滴度为2.62×1010cfu/ml.亲和层析后得到的纯化抗体可抑制胶原诱导的血小板聚集而对二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集无明显影响.结论 利用噬菌体抗体库技术表达的人源化抗血小板GPⅥ抗体ScFv片段可抑制血小板聚集功能.
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特异结合人禽流感病毒H5N1的scFv分子性能鉴定
目的 从人源化噬菌体抗体库(human single fold scFv libraries I+J)中筛选到能高亲和性、特异结合人禽流感病毒H5N1的单链抗体,为建立H5N1快速筛查试剂和人源化治疗单抗奠定基础.方法 以H5N1病毒的血凝素(hemagglutitin,HA)蛋白和核蛋白(nucleoprotein,NP)为目的 蛋白,对上述单抗噬菌体文库以亲和性为原理进行筛选,经过3轮筛选富集后,随机挑选了96个噬菌体克隆扩增培养,ELISA法挑选能特异性、高亲和性结合目的 蛋白的噬菌体克隆,并换用HB2151宿主菌对阳性单链抗体克隆进行可溶性表达,ELISA法鉴定可溶性单链抗体的结合活性,PCR扩增阳性克隆的轻、重链基因片段,并对阳性单链抗体分子测序和序列分析.结果 经过3轮筛选,分别从96个噬菌体克隆中挑选到了两株能特异结合NP蛋白、3株能特异结合HA蛋白的单链抗体,PCR扩增都得到了长为300、302和935 bp的轻链、重链和轻链-连接片段-重链的基因片段,测序结果分析发现上述5条单链抗体片段在轻链的47、49、50、51、53、54、56、96、97、98和99位的氨基酸组成不同,而特异结合NP蛋白的单链在重链区域氨基酸组成完全相同,而特异结合HA蛋白的单链在重链的44、47、85、86、87、88和89位氨基酸组成不同.结论 从噬菌体抗体库中筛选到的特异结合HA和NP蛋白的单链抗体片段,可为进一步研发H5N1快速筛选试剂和人源性治疗抗体奠定基础,也可为鉴定HA和NP蛋白中的抗原决定簇提供结构信息.
关键词： 人禽流感病毒H5N1 人源化单链抗体 噬菌体文库 构建 筛选 -
噬菌体抗体库中筛选特异结合新甲型H1N1病毒scFv分子的研究
目的 从人源化噬菌体抗体库中筛选到能高亲和性、特异结合新甲型H1N1流感病毒的单链抗体,为分析H1N1病毒抗原中和表位的活性位点和人源化治疗单抗奠定基础.方法 将细胞培养的新型H1N1病毒毒株,经超速离心浓缩纯化后,获得纯的新甲型H1N1病毒,以新甲型HIN1病毒为靶蛋白,以亲和结合为原理,筛选噬菌体scFv抗体文库,经过3轮筛选富集后,随机挑选了96个噬菌体克隆扩增培养,ELISA法挑选能特异性、高亲和性结合目的蛋白的噬菌体克隆.结果 经过3轮富集性的亲和筛选,分别从96个噬菌体克隆中挑选到了4株能特异结合新甲型H1N1病毒,而不结合季节性H1N1病毒的单链抗体分子,且PCR扩增都得到了长为368、527和935 bp的轻链、重链和轻链-连接片段-重链的基因片段.结论 从噬菌体抗体库中筛选到的特异结合新甲型H1N1病毒的单链抗体片段,可为进一步研发新甲流的H1N1快速筛选试剂和人源性治疗抗体奠定基础,也可为鉴定新甲型H1N1病毒中的抗原决定簇提供结构信息.
