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致肾盂肾炎大肠杆菌132特异性基因的筛选
目的 通过抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,比较致肾盂肾炎大肠杆菌132(UPEC132)与非致病性E.coli K-12 MG1655之间基因组的差异,筛选UPEC132特有的基因片段.方法 应用SSH技术构建UPEC132(tester)与非致病性E.coli K-12 MG1655(driver)菌株差异DNA消减文库,经PCR和斑点印迹法筛选鉴定阳性克隆,并进行测序及生物信息学分析.结果 获得约1600个重组菌的UPEC132消减文库,随机挑取其中的300个克隆,有37个含有UPEC132特异的DNA序列.特异性片段测序后进行生物信息学分析,发现与其相关的37个基因为UPEC132所特有,其中1个为新发现的DNA片段,9个为与致病相关基因,7个为与代谢和物质转运相关基因,2个为与外膜蛋白相关基因,3个为与调节相关基因,10个为未知功能蛋白的基因,其他5个为功能未分类的基因.结论 SSH技术是筛选病原菌特异基因的有效方法,已确定了37个UPEC132的特异基因,为进一步阐明其致病分子机制打下了基础.
关键词： 致肾盂肾炎大肠杆菌 抑制性消减杂交技术(SSH) 特异基因 斑点印迹 -
益气活血中药复方与CVB3对乳鼠心肌细胞葡萄糖转运体2表达的影响
目的 研究益气活血中药复方与CVB3对乳鼠心肌细胞葡萄糖转运体2表达的影响,以期从基因水平揭示CVB3心肌炎的发病机制及益气活血中药复方治疗病毒性心肌炎的作用机制,并进一步证实益气活血中药复方是治疗CVB3病毒性心肌炎的有效方剂.方法 通过改良的抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),分离大鼠心肌细胞CVB3感染组和益气活血中药复方给药组差异表达的基因,并通过荧光RT-PCR对上述结果进行验证.结果 SSH结果显示益气活血中药复方治疗组中葡萄糖转运体2基因的表达比CVB3病毒组中低,这一结果通过荧光RT-PCR得到验证.结论 核糖体蛋白S20基因表达上调可能是CVB3致病毒性心肌炎机制之一;益气活血法能够通过下调核糖体蛋白S20基因的表达而实现治疗病毒性心肌炎的目的.
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益气活血中药复方影响CVB3病毒性心肌炎模型乳鼠心肌细胞MCP-1、Rps4基因表达的实验研究
目的:观察益气活血中药复方对CVB3病毒性心肌炎模型大鼠心肌细胞small inducible cytokine A2(MCP-1/CCL2)、ribosomal protein S4基因表达的影响,以期从基因水平揭示益气活血中药复方治疗CVB3心肌炎的作用机制,进一步证实益气活血中药复方是治疗CVB3病毒性心肌炎的有效方剂.方法:通过改良的抑制性消减杂交技术(SSH),克隆了受CVB3攻击的宿主细胞中被中药调控的基因,并通过荧光rt-PCR对上述结果进行验证.结果:益气活血中药复方能够上调CVB3病毒性心肌炎模型大鼠心肌细胞small inducible cytokine A2(MCP-1/CCL2)、ribosomal protein S4基因的表达.结论:益气活血中药复方可能通过调节small inducible cytokine A2(MCP-1/CCL2)、ribosomal protein S4基因的表达而实现治疗病毒性心肌炎的目的.
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益气活血中药复方对CVB3乳鼠心肌细胞感染模型NADH脱氢酶亚基1和2表达的影响
目的:研究益气活血中药复方对CVB乳鼠心肌细胞感染模型NADH脱氢酶亚基1和2表达的影响,以期从基因水平揭示益气活血中药复方治疗CVB3心肌炎的作用机制,进一步证实益气活血中药复方是治疗CVB3病毒性心肌炎的有效方剂.方法:通过改良的抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),分离大鼠心肌细胞病毒组和益气活血中药复方给药组差异表达的基因,并通过荧光RT-PCR对上述结果进行验证.结果:SSH结果显示中药组中NADH脱氢酶亚基1和NADH脱氢酶亚基2基因的表达均比病毒组中低,这一结果通过荧光RT-PCR得到验证.结论:益气活血法能够通过调节NADH脱氢酶亚基1和2的表达而实现治疗病毒性心肌炎的目的.
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SSH技术筛选β干扰素真核表达载体转染细胞的下调基因
筛选β-干扰素质粒转染下调相关基因.以β-干扰素表达质粒pcDNA3.1(-)-IFN β转染HepG2细胞,同时以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaI酶切后将来自pcDNA3.1(-)转染的cDNA分成两组,分别与两种不同的接头adaptor1和adaptor2衔接,再与来自pcDNA3.1(-)-IFNβ转染的cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析.成功构建人β-干扰素质粒转染下调相关基因差异表达的cDNA.所获得的50个克隆中,随机挑选37个克隆均含有插入片段,将这些克隆进行序列测定,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得22种编码基因,其中3种为未知功能的基因.筛选到的cDNA序列,包括与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的一些蛋白编码基因.
关键词： β-干扰素 下调 抑制性消减杂交技术(SSH)
