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肠道病毒71型3D蛋白结构与功能研究进展
手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是儿童常见的急性传染病.肠道病毒71型(enterovirus,EV71)是HFMD的主要病原体之一,在我国HFMD的发病率较高,主要感染对象是婴幼儿,EV71感染也是目前导致HFMD重症患儿的主要的病原体.我国于2008年5月2日将HFMD列为丙类法定传染病.HFMD的致病机理尚未明确,目前还未研发出能够有效治疗此类病毒的药物.EV71中的非结构蛋白3D能够催化病毒基因组的复制和转录,是开发抗EV71病毒药物的重要靶标之一.本文就EV713D蛋白的结构、功能作一综述,为抗病毒药物的研发提供参考.
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肠道病毒71型2A、3C、3D蛋白的研究进展
肠道病毒71型(Enterovirus type 71,EV71)感染是引起神经系统紊乱、肺水肿、肺出血等严重疾病的主要原因.非结构蛋白2A、3C、3D是EV71在宿主细胞内完成复制和存活的基础,具有不同于肠道病毒其他成员的结构和作用机制.2A和3C蛋白可抑制宿主细胞蛋白的表达,从而促进细胞凋亡,3C蛋白还可抑制天然免疫,3D蛋白与病毒的耐高温和高度变异适应性有关.一些小分子物质可在病毒入侵的不同阶段抑制EV71感染.本文就2A、3C、3D蛋白在EV71复制过程中的结构与功能特点以及一些小分子物质在病毒复制中的抑制作用作一综述.
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肠道病毒71型不同病毒株3D蛋白对细胞损伤的作用
目的 比较肠道病毒71型(EV71)SDLY11株和SDLY107株3D蛋白对细胞的损伤程度.方法 EV71病毒株SDLY11和SDLY107分别取自轻症手足口病患儿和重症手足口病患儿.反转录PCR扩增目的基因11-3D-Flag和107-3D-Flag,分别将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,连接产物转化至大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切和测序鉴定.重组质粒转染人横纹肌肉瘤(RD)细胞,间接免疫荧光试验和蛋白质印迹检测3D蛋白表达,乳酸脱氢酶(LDH)检测3D蛋白导致的细胞损伤,噻唑蓝(MTT)比色法测定3D蛋白对细胞增殖的影响,Annexin-V/Pl双染法测定3D蛋白引起的细胞凋亡.各组间两两比较方差齐采用LSD-t检验,方差不齐采用Dunnett T3检验.结果 反转录PCR扩增获得1 400 bp片段,酶切鉴定重组质粒后分别获得1 400 bp和5 400 bp片段,测定序列与目的基因一致.间接免疫荧光试验观察到特异性荧光,蛋白质印迹显示目的蛋白相对分子质量为55×103.LDH结果显示SDLY11株3D蛋白转染组的吸光度(A)490值高于SDLY107株3D蛋白转染组,分别为0.790±0.048和0.641±0.018,差异有统计学意义(t=5.14,P<0.05),SDLY11株3D蛋白引起的细胞膜损伤情况较SDLY107株3D蛋白严重.MTT比色法结果显示SDLY11株3D蛋白转染组的A570值低于SDLY107株3D蛋白转染组,分别为1.028±0.020和1.081±0.002,差异有统计学意义(t=3.31,P<0.05),SDLY11株3D蛋白对细胞增殖活性的影响大于SDLY107株3D蛋白.Annexin-V/PI双染法结果显示,SDLY11株3D蛋白转染组和SDLY107株3D蛋白转染组的细胞凋亡百分比分别为(1.471±0.246)%和(1.465±0.237)%,差异无统计学意义(t=0.04,P=0.973).结论 与SDLY11株3D蛋白相比,SDLY107株3D蛋白引起的细胞损伤程度较轻微,且对细胞增殖活性的影响较弱,更有利于病毒在细胞内的复制.
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肠道病毒71型3D蛋白研究进展
目的 EV71感染可引起婴幼儿手足口病,甚至导致死亡.近年来由EV71引发的手足口病一直呈上升的流行趋势.目前中国对于手足口病的疫苗研究已进入临床试验阶段,但EV71引起的重症手足口病的发病机制仍不明确.3D蛋白主要负责病毒的复制过程,是抗病毒药物的靶点之一.本文就EV71的3D蛋白的结构功能及针对其作为靶点的抗病毒药物作一综述.
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肠道病毒71型3D重组病毒的拯救
目的利用反向遗传技术将肠道病毒71型(EV71)弱毒株SDLY1的3D蛋白置换入强毒株SDLY107,拯救重组病毒,为EV71 3D蛋白的研究提供操作平台.方法利用重叠PCR的方法得到3D编码区的重组片段,T-A克隆插入pMD19-T载体.通过双酶切、T4连接将其置换到含有SDLY107株全长的质粒pMD19-T-107中.体外转录获得感染性RNA,转染Vero细胞,盲传3代得到重组病毒SDLY 107(1-3D),通过PCR和qRT-PCR对重组病毒进行鉴定.结果PCR扩增得到大小为600、1 400和200 bp的3D区及其左右片段;重叠PCR扩增得到大小为2 100 bp的1-3D片段;双酶切鉴定重组质粒得到大小为7 400和2 700 bp的片段,测序结果证实3D区置换成功;感染性RNA转染Veto细胞后,接种至第3代时观察到细胞皱缩变圆,折光性增强;PCR鉴定重组病毒得到大小为226 bp的片段;qRT-PCR检测到细胞中病毒量于24 h开始缓慢增加,48 h后快速增多,至72 h后病毒量不再增长.结论成功拯救了重组病毒SDLY107 (1-3D),为进一步研究3D蛋白的毒力和其在EV71致病机制中的作用提供基础.
