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结核分枝杆菌FtsZ抑制剂的筛选和活性研究
目的筛选结核分枝杆菌 FtsZ 的特异性抑制剂，为抗结核药物的研发提供先导化合物。
方法应用本实验室已经建立的结核分枝杆菌 FtsZ 抑制剂筛选模型对化合物库进行筛选，获得能够抑制 FtsZ 的化合物202E，对其进行 IC50以及分子水平活性测定，并利用 DS 4.0软件将化合物202E 与 FtsZ 的活性位点进行对接。
结果化合物202E 能够抑制结核分枝杆菌 FtsZ 的 GTP酶活性，其 IC50为15.46μmol/L。202E 还能够抑制 FtsZ蛋白的聚合。通过分子对接，发现202E 能够与 FtsZ 的GTP 结合位点结合，抑制 FtsZ 的 GTP 酶活性。
结论化合物202E 是活性较好的结核分枝杆菌 FtsZ 抑制剂。 -
靶向FtsZ先导化合物的筛选及其抗结核作用探讨
目的:筛选可能作用于结核分枝杆菌FtsZ靶点的化合物,并且评价化合物的抗结核作用.方法:以结核分枝杆菌FtsZ为靶点,通过Discovery Studio虚拟筛选,选择候选化合物.测定候选化合物抑制FtsZ的GTP酶活性的IC50,并通过对耻垢分枝杆菌抑制的MIC评价其抗结核作用.结果:对化合物库(5 000个化合物)虚拟筛选,得到3个打分较高的化合物.体外实验发现这3个化合物能够在体外抑制结核分枝杆菌FtsZ的GTP酶活性,其IC50分别为9.96,14.02,16.17 μmol·L-1.并且这3个化合物都具有抗耻垢分枝杆菌活性.结论:通过虚拟筛选得到的3个化合物将为抗结核药物的研发提供线索,也对药物虚拟筛选和基于结构的药物开发提供新的信息.
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反义RNA靶序列对大肠杆菌ftsZ基因沉默效果的影响
目的 筛选出能够有效引起大肠杆菌ftsZ基因沉默的反义RNA片段.方法 利用携带pairedtermini结构的质粒模仿天然asRNA的二级结构表达稳定的反义RNA,通过平板生长表象观察、菌体形态变化及液体培养生长速率变化考察了不同反义靶序列对大肠杆菌ftsZ基因沉默效果的影响.结果 ftsZ1、ftsZ4和ftsZ5 3个反义RNA片段可有效引起相关基因沉默.结论 获得的ftsZ1、ftsZ4和ftsZ5 3个反义RNA片段可进一步用于ftsZ特异性酶抑制剂的超敏全细胞模型构建.
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细胞分裂蛋白FtsZ抑制剂的研究进展
细菌耐药性问题日益严重,越来越多的致病菌对现有抗生素产生了耐药性.开发新靶点的抗生素迫在眉睫.FtsZ 是介导细菌细胞分裂的关键蛋白,由于与人类微管蛋白序列的差异,有可能设计选择性作用于细菌FtsZ而不干扰宿主细胞的抑制剂,FtsZ蛋白有希望成为抗菌药物研究的新靶点.本文从人类微管蛋白抑制剂、GTP类似物、天然产物和化合物库广筛等方面综述了以FtsZ为靶点的抗菌药物研究的新进展.
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N末端的缺失对牙龈卟啉单胞菌FtsZ体外聚合的影响
目的:探讨N末端的缺失对牙龈卟啉单胞菌FtsZ体外聚合的影响.方法:将质粒pEZ1(PgFtsZ,携带野生型牙龈卟啉单胞菌FtsZ的基因)、pYWN1(ZΔN01, 携带PgFtsZ 的N末端去除了43个保守性氨基酸残基的缺失变异型PgFtsZ的基因)和pYWN2(ZΔN02, 携带PgFtsZ 的N末端去除了205个保守性氨基酸残基的缺失变异型PgFtsZ的基因)分别导入Escherichia coli BL21(DE3)pLysS中表达,通过IPTG诱导表达目的蛋白质,6 mol/L尿素变性及HiTrap SP层析柱纯化目的蛋白质,后通过沉淀法检测10 mmol/L的MgCl2、CaCl2和MnCl2对PgFtsZ、ZΔN01和ZΔN02体外聚合的影响.结果:10 mmol/L的MgCl2、CaCl2和MnCl2均能诱导PgFtsZ和ZΔN01出现聚合反应,然而10 mmol /L的MgCl2和CaCl2没能引起ZΔN02的体外聚合,而仅有10 mmol /L的MnCl2能诱导ZΔN02出现聚合反应,但效果不如PgFtsZ和ZΔN01明显.结论:PgFtsZ的N末端的43个氨基酸残基对Mg2+、Ca2+和Mn2+诱导其体外聚合反应影响不大,而后的162个氨基酸残基在PgFtsZ的体外聚合过程中起着关键的作用.
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细菌骨架蛋白结构与功能进展?
自20世纪初细胞骨架概念提出之后，细胞骨架一直被认为是真核生物所特有的结构。但近年人们在细菌等原核生物中也发现了原核类似骨架蛋白。存在于细菌中的 FtsZ、MreB和CreS分别与真核细胞骨架蛋白中的微管蛋白、微丝蛋白及中间丝类似，是细菌骨架蛋白研究中为重要的分子。FtsZ能在细菌分裂位点装配成 Z环结构，参与细菌分裂的调控；MreB沿着细胞膜内侧形成螺旋状结构，具有维持细胞形态和调控染色体分离等功能；CreS是发现仅存在于新月柄杆菌中的中间丝类似蛋白，它于细胞凹面的膜下形成弯曲丝状，贯穿整个细菌纵轴呈现长度短的螺旋丝状结构，对维持新月柄杆菌细胞的形态具有重要作用。
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以FtsZ为靶点的抗结核药物筛选模型的建立及应用
目的 发现结核分枝杆菌FtsZ的特异性抑制剂,为开发针对该靶点的新型抗结核化合物奠定基础.方法 克隆和表达结核分枝杆菌FtsZ蛋白并优化其酶活测活方法,构建FtsZ抑制剂的高通量筛选模型;对化合物库中2万个化合物进行筛选,将筛选得到的抑制剂212H进行IC50以及分子水平活性测定;用菌液稀释法评价212H对结核标准株、临床分离株以及耐药株的抗结核活性.结果 得到了较纯的结核分枝杆菌FtsZ蛋白,建立并优化了FtsZ酶活测定体系以及其抑制剂的高通量筛选模型,筛选得到1个具有较高抑制率的抑制剂212H,该抑制剂具有显著的体外抗结核活性.结论 建立了稳定的结核分枝杆菌FtsZ抑制剂的高通量筛选模型,应用该模型筛选得到的抑制剂具有抗结核活性.
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牙龈卟啉单胞菌FtsZ第322位的甘氨酸在细胞分裂中的作用
目的:探讨牙龈卟啉单胞菌FtsZ(PgFtsZ)第322位的甘氨酸在细菌细胞分裂过程中的作用.方法:通过site-directed mutagenesis技术,采用megaprimer方法,使用三个引物进行两轮的PCR,构建PgFtsZ第322位甘氨酸的点变异型质粒pYW9(ZG322P,携带PgFtsZ第322位甘氨酸由脯氨酸取代的点变异型基因)和pYW10(ZG322H,携带PgFtsZ第322位甘氨酸由组氨酸取代的点变异型基因),然后将质粒pYW9、pYW10和pEZ1(携带野生型PgFtsZ的基因)分别转化到Escherichia coli BL21(DE3)pLysS中进行表达、分离和纯化目的蛋白质.同时将载体pET3a也转化到E.coli BL21(DE3)pLysS中作为阴性对照.进一步通过免疫印迹法鉴定构建的点变异型ZG322P和ZG322H.E.coli的形态通过显微镜观察.结果:野生型PgFtsZ的过表达导致E.coli细胞分裂的明显抑制,含质粒pEZ1的E.coli和仅含有载体作为对照的E.coli相比延长大约20倍.然而点变异型ZG322P和ZG322H的过表达并未引起E.coli细胞分裂的抑制,即含质粒pYW9的E.coli和含质粒pYW10的E.coli表现出正常的形态,与仅含有载体作为对照的E.coli细胞的形态相似.免疫印迹分析表明野生型PgFtsZ、点变异型ZG322P、ZG322H在相同位置出现阳性带,并且表达水平相似.结论:牙龈卟啉单胞菌FtsZ第322位的甘氨酸在细菌细胞分裂中起着重要的作用.
