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RHD基因3'-非编码区序列分析
RHD基因下游包括3'-端非编码区、下游Rh盒子和SMP1基因等,3'-端非编码区的具体序列目前尚不清楚.本研究目的旨在测定3'非编码区序列.根据近的文献报道和EMBL/GenBank/DDBJ记录的基因序列,设计1对引物,建立聚合酶链式反应(PCR)方法,特异性扩增10名Rh阳性表型和10名D放散型(Del)表型个体的DNA样品的RHD基因3'-端非编码区全长序列,PCR产物纯化后进行直接测序.结果表明:10份Rh阳性和10份Del DNA样品的测定结果完全一样,显示RHD基因终止密码子与RHD基因的下游Rh盒子首位碱基之间相距103bp,无重复序列等特殊片段;D放散型等位基因的3'-非编码区与正常Rh阳性个体一致.结论:D放散型D抗原减弱与3'-非编码区无关.
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miR-20b直接靶向3'-UTR负性调节VEGF的表达
目的 探讨miR-20b是否直接靶向VEGF3'-非编码区(3'-UTR)而调控其表达.方法 采用miRanda软件预测VEGF3'-UTR是否存在miR-20b的结合位点;使用PCR方法扩增RAW264.7细胞VEGF基因3'-UTR序列,经双酶切后克隆到pmiR-RB-ReportTM质粒海肾荧光素酶的下游,得到pmiR-RB-Repor tTM-VEGF 3'-UTR双荧光素酶重组质粒,使用电泳法和测序法进行验证;将重组质粒或空质粒与miR-20b模拟物或其对照共转染HeLa细胞,24 h后检测相应荧光素酶活性.结果 VEGF3'-UTR存在miR-20b的结合位点;获得了含VEGF 3'-UTR的双荧光素酶报告载体;重组质粒与miR-20b模拟物共转染组HeLa细胞的荧光素酶活性明显低于空质粒转染组(P＜0.05).结论 成功构建小鼠VEGF基因3'-UTR双荧光素酶报告载体,miR-20b可以直接靶向VEGF3'-UTR而负性调控其表达.
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FOXP3基因3'-UTR段双荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定
目的:构建FOXP3基因3'-UTR双荧光素酶基因报告载体,并通过检测荧光素酶活性,初步分析可能调控FOXP3基因表达的miRNAs.方法:利用PCR方法,根据FOXP3基因3'-UTR序列信息设计其扩增引物,以293T细胞基因组DNA为模板PCR扩增FOXP3基因的3’-UTR序列,将其克隆到pmiRB-REPORT双荧光素酶报告载体中;运用Targetscan软件预测可能与FOXP3基因3’-UTR相互作用的miRNAs;利用LipofectaminTM 2000试剂将miRNAs mimics与构建好的FOXP3基因3’-UTR段双荧光素酶报告载体共转染于常规培养的293T细胞中,然后使用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性,并与空白对照相比较.结果:经酶切及基因测序验证,成功构建含有FOXP3基因3’-UTR段双荧光素酶基因报告载体;Targetscan软件预测显示,FOXP3基因3’-UTR可能是miR 608的作用靶位点;双荧光报告显示,miR 608 mimics组比空白对照组[(0.700 0±0.016 41)比(1.000±0.055 75) (P＜0.001)] FOXP3基因3’-UTR双荧光素酶基因报告载体的荧光素酶活性下降30％.结论:FOXP3基因3’-UTR段双荧光素酶基因报告载体构建成功,初步证实miR 608对FOXP3有调控作用.
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MiR-20b直接靶向3'-UTR调控HIF-1α表达
目的:探讨微小RNA-20b (micro RNA-20b/miR-20b) 是否直接靶向低氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α) 信使RNA的3'-非编码区 (3'-untranslated region, 3'-UTR) 调控其基因表达.方法:采用Target Scan和miRanda算法预测HIF-1α3'-UTR区是否存在miR-20b的配对序列;构建并鉴定表达HIF-1α3'-UTR的双荧光素酶基因报告系统 (pmiRRB-ReportTM-HIF-1α3'-UTR) , 将重组质粒 (recombinant plasmid, RP) 与mimics-miR-20b (M) 或NC-miR-20b (N) 共转染He La细胞, 本研究共分为RP、RP+M、RP+N、P、P+M和P+N六组, 24 h后检测各组双荧光素酶活性的比值.结果:HIF-1α3'-UTR区存在miR-20b配对区域;成功构建了含HIF-1α3'-UTR序列的双荧光素酶基因报告载体;重组质粒与mimics-miR-20b共转染的He La细胞荧光素酶活性明显低于其他对照组 (P=0.022) .结论:miR-20b可以直接靶向结合HIF-1α3'-UTR区负向调控其表达.
关键词： 低氧诱导因子 3'-非编码区 miR-20b 双荧光素酶基因报告系统
