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问号钩端螺旋体mce基因及其编码蛋白特征的初步分析
目的 建立基于mce基因的PCR检测方法,分析问号钩端螺旋体(钩体)mce基因保守性,获得钩体mce基因生物信息学分析结果.方法 以NCBI/Blast、NCBI/Cds软件搜索Mce内部存在的保守功能结构域及mce基因的特异性；采用TMHMM Server-2.0预测所编码蛋白跨膜区结构；根据已报道问号钩体赖株mce基因设计引物,采用PCR扩增问号钩体赖株全长mce基因,测序并使用DNAStar软件进行测序结果比对.以13株国内流行问号钩体菌株基因组DNA为模板,对基于mce基因PCR检测方法进行验证.扩增产物进行测序、比对,同时根据推定的氨基酸序列做系统发生树.结果 生物信息学研究表明,Mce含有与病原菌黏附侵袭相关的Mce超家族保守功能结构域；Mce中存在一明显的跨膜结构；同时,mce基因特异存在于问号钩体中；所克隆的mce基因与已报道序列(GenBank accession No.:NP_712236)一致；PCR检测结果表明,我国13株问号钩体株均携带mce基因；核苷酸和氨基酸序列相似性均＞95％.结论 问号钩体mce基因特异、保守存在于各致病性的问号钩体中；Mce具有明显的跨膜结构并含有Mce超家族结构域,与问号钩体黏附侵袭宿主细胞有关.
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不同血清群问号钩端螺旋体mce基因序列分析及表达模式的研究
目的:确定问号钩端螺旋体(简称钩体)株携带侵袭相关mce基因情况,原核表达mce基因并制备其抗血清,了解问号钩体感染细胞前后mce基因转录水平的变化.方法:采用PCR扩增13株问号钩体和1株双曲钩体全长mce基因片段,T-A克隆后测序.采用基因工程技术构建mce基因原核表达系统,SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图象分析系统检查目的重组蛋白rMce表达情况,采用Western Blot对表达的rMce进行鉴定.采用皮内免疫法制备兔抗rMce血清,免疫双扩散试验测定其效价.采用实时荧光定量RT-PCR,检测问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染J774A.1细胞前后mce基因转录水平的变化.结果:我国13株问号钩体株均携带mce基因,双曲钩体三宝垄群patoc型Patoc Ⅰ株则否.与报道的序列(GenBank accession No.:NP712236)比较,所克隆的mce基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.02%～100%和97.91%～100%.所构建的mce基因原核表达系统能表达rMce,其产量为细菌总蛋白的5%.问号钩体56601株全菌抗血清能有效识别rMce.问号钩体56601株感染细胞后mce基因转录水平明显上调.结论:mce基因仅存在于致病性的问号钩体中,且其转录水平呈细胞接触上调模式,表明该基因与问号钩体致病性密切相关.mce基因产物是序列保守的外膜蛋白.所构建的mce基因原核表达系统及所制备的rMce抗血清为深入研究该基因功能提供了有效的手段.
