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布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析法快速检测技术的建立
目的 建立一种快速检测布鲁氏菌抗体的新方法. 方法 利用胶体金免疫层析技术,以大肠埃希菌表达、纯化的OMP31与BP26重组蛋白作为检测抗原,以金黄葡萄球菌A蛋白(SPA)作为胶体金标记物,制备胶体金免疫层析试纸条,用于检测布鲁氏菌抗体,并分析方法的敏感性和特异性. 结果 以粒径为40 nm胶体金制备的试纸条检测布鲁氏菌抗体的敏感性高,胶体金佳标记pH为6.2,SPA蛋白适标记量为6μg/ml.交叉试验证明试纸条不与其他非相关疾病感染血清反应,特异性高.试纸条检测结果与琥红平板试验方法的符合率为92％. 结论 制备的布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,可用于鉴别布鲁氏菌自然感染和人工免疫,并可区分牛、羊种布鲁氏菌感染,可在基层推广使用.
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羊布鲁菌OMP31蛋白基因表达及抗原性分析
目的 构建布鲁菌OMP31蛋白原核表达载体,获得OMP31蛋白.方法 PCR扩增OMP31基因,连接入pET-30a(+)表达载体中,构建pET-30a(+)/OMP31质粒,双酶切鉴定、测序正确后,转化人大肠埃希氏菌BL21(DE3)中,以不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,并通过二十烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析；蛋白质免疫印迹(western blot)初步分析其免疫原性.结果 成功构建pET-30a(+)/OMP31表达载体,并表达出OMP31蛋白,分子量约为31 kDa,主要以包涵体形式存在；通过复性获得＞95％的高纯度可溶性蛋白；以布鲁菌虎红平板阳性血清检测,显示复性后蛋白具有良好的免疫反应性.结论 成功表达出带组氨酸(HIS)标签的OMP31融合蛋白,且具有较好的蛋白抗原性.
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布鲁氏菌OMP31T-B联合表位抗原的免疫应答分析
目的:研究OMP31表位的抗原性和免疫应答特点,为布鲁氏菌表位疫苗的研制奠定基础.方法:利用生物信息软件筛选OMP31 T-B联合优势抗原表位,进一步合成肽段.用OMP31肽段免疫BALB/c小鼠,采用ELISA检测小鼠血清中特异性IgG1和IgG2a抗体水平,ELISPOT检测脾淋巴细胞中IFN-γ阳性的T淋巴细胞活化情况.结果:用OMP31合成肽段免疫BALB/c小鼠4次后,小鼠血清中IgG1和IgG2a抗体水平升高,小鼠脾淋巴细胞集落形成单元(SFU)增高.结论:OMP31 T-B联合表位抗原能增强小鼠Th1免疫应答和体液免疫应答,可以作为布鲁氏菌病的候选疫苗.
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重组布氏杆菌BP26蛋白和OMP31蛋白作为间接ELISA诊断抗原的研究
目的传统布氏杆菌病血清学方法因其抗原构成复杂,存在较严重的交叉免疫反应性,导致结果判定困难.BP26 及OMP31分别为布氏杆菌细胞周质蛋白及外膜蛋白,在感染牛、绵羊、山羊、犬和人类均为优势免疫原,且在抗原性上具有较好的布氏杆菌种属特异性.方法以大肠杆菌表达、纯化的BP26和OMP31重组蛋白为包被抗原,初步建立了检测血清特异抗体的间接ELISA方法,并以现地牛布氏杆菌普查检测血清100份为样本,与传统的试管凝集试验进行了比较研究.结果试管凝集试验血清样本阳性率为15%(15/100);BP26包被抗原ELISA检测判为阳性的12个样本中有11为试管凝集反应阳性,相对阳性率为73.3%,二者阳性符合率为92%(11/12);而采用OMP31为包被抗原,阳性检出率为0(图5).结论被检测区域阳性牛主要感染布氏杆菌为牛种布氏杆菌(B.abortus 天然缺失OMP31基因);BP26作为间接ELISA包被抗原用于牛布氏杆菌血清学检测具有良好的特异性及较好的敏感性.
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不同铝佐剂明显增强布鲁菌外膜蛋白31(Omp31)的免疫接种效果
目的 探讨磷酸铝(AP)和氢氧化铝(AH)佐剂对布鲁菌外膜蛋白31(Omp31)诱导产生体液、细胞免疫反应以及免疫保护作用的影响.方法 制备AP佐剂以及AH佐剂,并与纯化的布鲁菌Omp31进行混合吸附,检测吸附率;将AP、AH吸附完成的Omp31蛋白分别于0、2、4周腹腔注射免疫BLAB/c小鼠,同时设立未吸附佐剂的Omp31蛋白免疫组与PBS免疫组作为对照.分别于0、2、4、6周ELISA检测小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a水平以及生殖道分泌物分泌型IgA (sIgA)水平;于第6周取小鼠脾细胞体外培养,Omp31刺激细胞48 h后,ELISA检测培养细胞上清中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素10(IL-10)水平,CCK-8法检测小鼠淋巴细胞增殖情况;小鼠于第6周用布鲁菌强毒株进行攻击,并分别于攻击后1周、2周检测小鼠脾脏组织菌体含量.结果 AP、AH佐剂对于不同浓度Omp31吸附率分别可达到70％与85％以上;ELISA结果显示AP组与AH组诱导产生的血清IgG、IgG1、IgG2a以及生殖道sIgA水平均在末次免疫2周后到峰值,其中AH组高于AP组,且均显著高于对照组;CCK-8实验结果显示AH组诱导的淋巴细胞增殖显著高于AP组,且均高于对照组,AH组脾细胞上清中的IFN-γ水平显著高于AP组,而IL-10水平无显著差异;强毒株16M攻击后2周,AH组小鼠脾脏菌体载量显著低于AP组.结论 AP佐剂以及AH佐剂均能有效增强布鲁菌Omp31的免疫原性及其抗感染保护作用,且AH佐剂效果好于AP佐剂.
