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mTOR 复合物在糖尿病肾病小鼠肾组织中的不同分布和表达
目的：探讨哺乳动物雷帕霉素靶分子复合物（ mTORC）在糖尿病肾病（ DN）小鼠肾组织中的分布、表达。方法14只C57BL/6小鼠随机分成对照组和DN组，每组各7只。 DN组小鼠予以链脲菌素腹腔注射建立小鼠DN模型，采用生化技术检测小鼠血、尿肌酐以及白蛋白水平，组织学染色检测肾脏病理变化，免疫荧光以及免疫印迹技术检测肾组织中mTOR、mTOR 第2448位丝氨酸磷酸化修饰后mTOR （ p-mTOR ）、mTORC1（ Raptor ）、mTORC2（Rictor）以及mTOR信号通路下游的效应蛋白磷酸化 S6K1（p-S6K1）的分布和表达。结果 DN组小鼠血糖、尿白蛋白/肌酐比值明显增加（P＜0．01），肾小球明显增大（P＜0．05）。 mTOR、Raptor以及Rictor在正常以及DN小鼠肾皮质和髓质中均有表达，主要表达在肾小球系膜区、毛细血管袢、皮质近曲小管以及外髓和内髓集合管上皮细胞中。其中正常小鼠内髓肾组织中未见p-S6K1表达，正常以及DN小鼠肾小球中未见p-mTOR表达。免疫印迹检测表明，DN小鼠肾组织中mTOR、p-mTOR、Raptor、Rictor以及p-S6K1均明显上升（P＜0．05）。结论 mTORC广泛分布于小鼠肾组织且参与DN的发生发展，但mTOR第2448位丝氨酸磷酸化并不直接参与高血糖介导的肾小球损伤。
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miRNA-99b负调控mTOR抑制脑胶质瘤细胞的侵袭能力
目的 研究miRNA -99b及mTOR在胶质瘤中的表达水平及其对脑胶质瘤侵袭能力的影响及机制.方法 用re-al-time PCR法检测脑胶质瘤组织与对照脑组织中 miRNA-99b及mTOR的表达.miRNA-99b 模拟物与野生型或突变型mTOR 3′ UTR重组载体共转染后,应用荧光素酶基因报告系统检测miRNA-99b是否与mTOR基因3′UTR结合.应用real-time PCR法和Western blot检测 miRNA-99b模拟物转染 U251细胞后,细胞中 miRNA-99b、mTOR mRNA 和mTOR 蛋白的表达,Transwell 法检测细胞的侵袭能力.mTOR质粒转染U251细胞后,检测细胞中miRNA-99b的表达及细胞的侵袭能力的变化.统计学分析miRNA-99b表达水平与胶质瘤及预后的相关性.结果 脑胶质瘤组织中miRNA-99b表达明显低于对照脑组织,mTOR mRNA表达明显高于对照脑组织;miRNA-99b 模拟物和野生型 mTOR 3′UTR重组载体共转染的 U251细胞的荧光强度明显降低.miRNA-99b 模拟物转染后,U251细胞中miRNA-99b的表达水平上升,而mTOR蛋白及mRNA的表达水平下降,U251细胞及侵袭能力下降.改变mTOR表达后,U251细胞中miR-NA-99b的表达水平无明显变化,升高mTOR表达能够恢复因miRNA-99b抑制的细胞侵袭能力.Kaplan-Meier生存分析及Log-rank检验显示,低表达 miRNA-99b患者的总生存期明显低于高表达组.结论 过表达miRNA-99b可能通过靶向调控mTOR抑制脑胶质瘤细胞的侵袭能力,miRNA-99b可作为脑胶质瘤的治疗靶点.
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下调miRNA-99b表达对脑胶质瘤细胞侵袭及mTOR/4E-BP1信号通路调控的影响
目的 探讨下调微小RNA(miRNA)-99b表达对脑胶质瘤细胞侵袭的影响及其作用机制. 方法 体外常规培养脑胶质瘤U251细胞.(1)将U251细胞分为空白对照组、无义序列对照组和miRNA-99b抑制物组,后2组分别转染无义序列和miRNA-99b抑制物,空白对照组不做任何处理.采用RT-PCR检测U251细胞中miRNA-99b、哺乳动物雷帕霉素靶分子(mTOR)mRNA的表达,采用Western blotting检测U251细胞中mTOR、真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)及磷酸化(p)-4E-BP1蛋白的表达,采用Transwell侵袭实验检测U251细胞的侵袭能力.(2)将U251细胞分为无义序列对照组、mTOR siRNA组,分别转染无义序列和mTOR siRNA.采用RT-PCR检测U251细胞中miRNA-99b、mTOR mRNA的表达,采用Western blotting检测U251细胞中mTOR、p-4E-BP1蛋白的表达.(3)将U251细胞分为miRNA-99b抑制物+无义序列对照组、miRNA-99b抑制物+mTOR siRNA组,分别转染miRNA-99b抑制物+无义序列、miRNA-99b抑制物+mTORsiRNA.采用Western blotting检测U251细胞中p-4E-BP1蛋白的表达,采用Transwell侵袭实验检测U251细胞的侵袭能力. 结果 (1)与空白对照组、无义序列对照组比较,miRNA-99b抑制物组U251细胞中miRNA-99b mRNA表达明显降低,mTORmRNA及蛋白表达明显升高,p-4E-BP1蛋白表达明显升高,穿膜细胞数明显增多,差异均有统计学意义(P＜0.05),而4E-BP1蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05).(2)与无义序列对照组比较,mTOR siRNA组U251细胞中mTORmRNA及蛋白表达明显降低,p-4E-BP1蛋白表达明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05),而miRNA-99bmRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05).(3)与miRNA-99b抑制物+无义序列对照组比较,miRNA-99b抑制物+mTOR siRNA组U251细胞中p-4E-BP1蛋白表达明显降低,穿膜细胞数明显减少,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 下调miRNA-99b表达可促进脑胶质瘤细胞侵袭,其作用机制与mTOR/4E-BP1信号通路调控有关.
