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下调骨细胞TGF-β/Smad4信号可抑制小鼠BMSCs成骨及破骨分化
目的检测骨细胞TGF-β/Smad4信号通路对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨和破骨分化的作用,并初步探讨其相关机制.方法用条件性基因敲减Cre/loxp技术特异性敲减骨细胞Smad4,获得下调骨细胞TGF-β/Smad4信号通路的小鼠;体外分离骨细胞并与野生型小鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)共培养;碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红(alizarin red)染色检测早期成骨分化和晚期钙盐沉积,酸性磷酸酶(TRAP)染色检测破骨细胞;real-time PCR检测成骨分化特异标志物Runx2、Osterix(OSX)、ALP、osteocalcin和破骨分化特异标志物RANKL和OPG 的mRNA表达水平.Western blot检测成骨分化特异标志物Runx2和osteocalcin和破骨分化特异标志物RANK蛋白表达水平.结果下调骨细胞TGF-β/Smad4信号能够抑制BMSCs成骨转录因子Runx2、Osterix(P<0.01)、成骨分化特异标志物ALP和osteocalcin(P<0.01)以及破骨分化特异标志物RANK(P<0.01)的表达;增加破骨分化抑制物OPG的表达(P<0.05);而RANKL的表达无明显变化;终下调了RANKL/OPG的比值(P<0.05).结论终末分化的骨细胞调控骨的代谢,下调其TGF-β/Smad4信号可抑制BMSCs成骨和破骨细胞的分化.
关键词： 骨细胞 TGF-β/Smad4 BMSCs 成骨分化 破骨分化 -
BMP2表达上调剂E40071体外抗骨质疏松活性研究
骨形态发生蛋白Ⅱ (bone morphogenetic protein 2,BMP2)在骨发育与重建中具有重要作用,本研究利用前期已构建的BMP2表达上调剂高通量筛选模型对20 000个化合物进行了筛选,得到阳性化合物E40071[2-(4-(5-甲基-3-苯基吡唑并[1,5-α]嘧啶-7-基)哌嗪-1-基)乙-1-醇],其EC50值为2.73μmol·L-1.体外活性研究表明,E40071能上调BMP2及其下游特异性转录因子Runx2、Osx的mRNA表达,并通过促进Smad1/5/8蛋白磷酸化,上调Runx2蛋白的表达;对成骨细胞碱性磷酸酶活性具有一定的上调作用;茜素红染色结果表明,E40071能够促进成骨细胞钙化.进一步研究发现,E40071能够明显抑制RANKL诱导小鼠巨噬细胞Raw264.7分化为破骨细胞,并降低破骨细胞分化标志MMP9和NFATc1蛋白的表达水平.研究结果表明,E40071可促进成骨细胞骨形成活性并抑制破骨细胞的分化.
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低浓度DMSO对RANKL诱导的RAW264.7细胞破骨分化的影响
① 目的 探讨低浓度二甲基亚枫(DMSO)对RANKL诱导的破骨细胞前体RAW264.7细胞破骨分化的影响.② 方法 将细胞接种在24孔板上,采用0、0.001％ 、0.005％ 、0.01％ 、0.05％ 、0.1％ 、0.15％ 、0.2％ 等八种低浓度的DMSO作用于RANKL诱导的RAW264.7,细胞4天后,各培养孔随机采集照片20张,用显微镜每孔随机收集20张照片,使用Image-Pro Plus6.0软件对每张图进行测量,记录每张照片中RAW264.7细胞的细胞总数及总面积.③ 结果 较RANKL组相比,DMSO浓度为0.005％ 和0.01％ 时,RAW264.7细胞形成破骨细胞的表面积均显著增大,差异有统计学意义(P<0.01),且0.005％ 和0.01％ 两组间差异无统计学意义(P>0.05);而DMSO浓度进一步提高为0.1％,0.15％,0.2％ 时,破骨细胞表面积随浓度升高而减小;DMSO浓度为0.001％,0.05％,0.1％ 时,破骨细胞表面积与未加DMSO组差异无统计学意义(P>0.05).④ 结论 DMSO浓度为0.005％ 和0.01％ 时促进RAW264.7细胞的破骨分化,而随着DMSO浓度的进一步提高,DMSO对RAW264.7破骨分化的促进作用消失,甚至表现为抑制破骨分化.
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miRNAs在牙周领域中的研究进展
微小分子RNA(microRNAs,miRNAs)是一类内源性非编码小分子RNA,miRNAs在基因表达调控方面具有广泛和普遍的作用,参与了细胞增殖、细胞分化、生物体发生发育等生物学过程.目前对于miRNAs的研究主要集中在肿瘤方面,对于口腔牙周领域的研究甚少,本文根据miRNAs与牙周组织研究的新进展,就其在牙周炎症性疾病以及成骨、破骨分化中的异常表达及可能机制方面作一论述.
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孕期尼古丁暴露所致子代胎鼠长骨宫内发育迟缓
目的:通过检测孕期尼古丁暴露胎鼠长骨病理学变化和尼古丁处理后原代成骨细胞基因表达的影响,探讨尼古丁影响长骨发育的可能机制.方法:健康Wistar雌性大鼠受孕后第9天起皮下注射给予尼古丁2 mg/(kg·d),孕20 d处死孕鼠收集胎骨,检测骨化中心病理学变化和基因表达;在原代成骨细胞成骨分化模型上给予不同浓度尼古丁处理7d,检测成骨和破骨分化基因表达.结果:与对照组相比,尼古丁组胎鼠股骨缩短,初级骨化中心长度缩短;尼古丁处理下调成骨细胞成骨分化基因runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(BGLAP)和骨涎蛋白(BSP)的表达,抑制破骨细胞分化因子(RANKL)表达,并呈现良好的剂量依赖关系.结论:孕期尼古丁暴露子代大鼠存在长骨发育迟缓,可能与成骨分化功能抑制有关.
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羟基磷灰石形貌对RAW264.7细胞破骨分化影响研究
目的 分析羟基磷灰石(HAp)不同形貌对小鼠单核RAW264.7细胞破骨分化性能的影响.方法 采用水热合成及pH调节的方法获得不同形貌羟基磷灰石微米颗粒,通过扫描电子显微镜(SEM)表征材料形貌.将不同形貌HAp与RAW264.7细胞共培养,通过Live/Dead活性染色检测HAp对细胞活性有无影响;并在RANKL破骨诱导因子的作用下通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、实时荧光定量(qRT-PCR)分析不同形貌HAp对RAW264.7细胞破骨分化的影响.结果 24h Live/Dead活性染色证实微棒与微球HAp均具有良好的生物相容性.qRT-PCR结果表明,两种形貌HAp均抑制RAW264.7细胞的破骨分化,而相对于微球HAp,微棒HAp抑制作用较显著.结论 羟基磷灰石形貌的差异能够引起RAW264.7破骨分化性能的差异表达.
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银杏叶中异鼠李素对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响及其分子机制
目的 探讨银杏叶中异鼠李素(isorhamnetin,ISO)对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响及其可能的相关分子机制.方法 在核因子κB受体活化因子配基(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞的同时,加入不同浓度的ISO(1～10μM),研究其对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响,通过CCK8法检测及评估各作用浓度ISO的细胞毒性,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resis-tant acid phosphatase staining,TRAP)染色及骨片吸收效果判定其对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响.实时定量PCR检测破骨细胞分化过程的标志性基因:TRAP、组织蛋白酶K(cathepsin K,Ctsk)、金属基质蛋白酶9(matrix metallo protein,MMP-9);分化相关转录因子:原癌基因c-Fos(proto-oncogene protein,c-Fos)、核转录因子激活的T细胞1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1)的表达及破骨细胞分化下游因子NF-κB p65信号通路的磷酸化水平.结果 不同浓度的ISO(1～10μM)对RAW264.7细胞无细胞毒性,并且能抑制TRAP活性,减少骨吸收陷窝数量,在浓度为10μM时为显著;ISO能显著降低TRAP、Ctsk、MMP-9、c-Fos、NFATc1及NF-κB p65的mRNA表达.结论 ISO对RAW264.7细胞向破骨细胞的分化具有抑制作用,其机制可能与经典NF-κB通路的抑制有关.
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周期性张、压应力作用下人牙周膜干细胞RANKL/OPG的变化
目的:对周期性张、压应力作用下人牙周膜干细胞(hPDLSCs)RANKL、OPG及RANKL/OPG比值的变化进行初步探讨.方法:用3000μstrain,0.5 Hz的周期性张、压应力对hPDLSCs分别加载0(对照组)、3、6、12、24 h.Western blotting检测RANKL和OPG的变化,计算RANKL/OPG比值的变化.结果:周期性张应力作用3 h,RANKL/OPG比值达到低点(0.902±0.196),显著低于对照组水平(P=0.000),此后开始上升,但直到24 h,仍低于对照组水平.周期性压应力作用3 h,RANKL/OPG比值达到高点(1.058±0.147),显著高于对照组水平(P=0.000),6 h(0.996±0.103)回落到对照组水平(P=0.152),此后直到24 h(0.8449±0.041),显著低于对照组水平(P=0.000).结论:周期性张、压应力都可以上调hPDLSCs的RANKL和OPG表达.在周期性张应力加载的初24 h,hPDLSCs不能促进破骨细胞分化;而周期性压应力加载的初6 h,hPDLSCs可以促进破骨细胞分化,此后转而抑制破骨细胞分化.
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杯苋甾酮抑制破骨分化和促进成骨分化的双向作用治疗骨质疏松症
目的 研究杯苋甾酮对破骨和成骨分化的影响,探讨其在改善骨质疏松中的作用.方法 以CCK8检测杯苋甾酮对小鼠源性单核巨噬细胞(BMMs)及前成骨细胞MC3T3E1的毒性作用;流式检测药物对细胞凋亡的影响.以TRAP染色观察破骨分化;以ALP染色评估成骨分化,以Real-Time PCR检测TRAP及ALP的表达. 15只小鼠分为假手术组、OVX组、治疗组.治疗组给予杯苋甾酮干预,余2组以生理盐水处理.4周后取胫骨,Micro-CT检测骨质及微观结构变化.结果 杯苋甾酮≤10 mg/L时对细胞无毒性(P＞0.05),不影响凋亡(P＞0.05).其可显著抑制破骨分化(P＜0.05),促进成骨分化.杯苋甾酮可抑制TRAP表达(P＜0.05),促进ALP表达(P＜0.05).杯苋甾酮可改善雌激素缺乏导致的骨质疏松.结论 杯苋甾酮通过抑制破骨、促进成骨的双向作用达到改善骨质疏松的作用.
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RAW264.7细胞与骨髓源巨噬细胞向破骨细胞分化特性的比较
目的 比较RAW 264.7细胞与骨髓源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs)向破骨细胞分化的特性.方法 骨髓原始细胞经巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)刺激3 d,免疫荧光鉴定是否为BMMs;RAW 264.7细胞与BMMs经核因子 κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL)诱导4 d后,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色和纤维肌动蛋白环染色鉴定破骨细胞,并比较两者诱导破骨细胞的效率,同时通过骨板吸收实验检测破骨细胞的骨吸收活性.结果 骨髓原始细胞经M-CSF刺激3 d后可得BMMs;RAW 264.7细胞与BMMs经RANKL诱导4 d后均可出现大量TRAP阳性多核破骨细胞且形成纤维肌动蛋白环,二者诱导破骨细胞的效率差异无统计学意义;骨板吸收实验显示RAW 264.7细胞与BMMs骨板上均形成较多的骨吸收瘢痕,且二者的骨吸收活性差异无统计学意义.结论 RAW 264.7细胞与BMMs向破骨细胞分化的特性无明显差异.
