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hR24L基因转染对MCF7细胞凋亡的影响
为研究人类DNA损伤修复基因hR24L与细胞凋亡的关系,首先用PCR方法扩增了hR24L基因的开放阅读框(ORF),成功地构建了正义和反义hR24L基因的逆转录病毒表达载体重组体.然后用这两种重组质粒转染MCF7细胞,筛选出的阳性克隆再分别用过氧化氢、丁酸钠和去血清饥饿诱导凋亡,用Northern印迹杂交分析hR24L基因表达情况,用流式细胞仪和电泳检测细胞凋亡.结果发现转染正义hR24L重组载体的细胞的hR24LmRNA表达水平升高,其凋亡面积所占比例(21.21±2.42)比对照细胞(46.16±4.38)明显降低;而转染反义hR24L重组载体的细胞的hR24LmRNA表达水平则下降,但其凋亡峰面积所占比例(31.05±3.02)比对照细胞也明显降低,表明两者均抑制过氧化氢和去血清饥饿诱导的凋亡,但它们对丁酸钠诱导的凋亡均无抑制作用.可见hR24L基因通过复杂的途径参与细胞凋亡的调控.
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HR24L基因过表达抑制细胞凋亡
目的:研究人类DNA 损伤修复基因HR24L与细胞凋亡的关系.方法:PCR方法扩增HR24L基因开放阅读框序列,克隆入逆转录病毒载体pDOR-neo,转染HeLa细胞,筛选阳性克隆;Southern印迹验证HR24L基因的整合状况.Northern印迹检查HR24LmRNA的细胞内表达水平.过氧化氢、丁酸钠及血清饥饿诱导凋亡,流式细胞计数仪检测凋亡比例,电泳观察DNA Ladder,Western印迹检测凋亡相关蛋白质的表达.结果:获得转染有HR24L基因的HeLa细胞.与HeLa细胞相比,HeLa-HR24L细胞HR24LmRNA表达明显上升.HR24L基因过表达导致Bcl-2的表达升高,抑制caspase-3和Bax的表达,而对p53却无明显的影响.HR24L基因过表达抑制过氧化氢和血清饥饿诱导的细胞凋亡,但对丁酸钠诱导的细胞凋亡却无抑制作用.结论:HR24L基因过表达抑制细胞凋亡.
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hR24L基因的克隆及逆转录病毒重组体的构建
目的克隆人类DNA损伤修复基因hR24L,并构建逆转录病毒表达载体重组体,为进一步研究该基因的功能及作用机制奠定基础.方法用PCR法扩增hR24L基因的开放阅读框(ORF),然后连接到pEGM-T载体中,经测序验证无突变后,再重组到逆转录病毒表达载体(pDor-neo)中,得到正义和反义重组体.结果建立了一种有效的基因克隆方法,成功地克隆了hR24L基因,获得了含有重组体的稳定遗传的细胞株.结论 PCR法是克隆hR24L基因的有效方法,成功构建逆转录病毒表达载体重组体是研究该基因的重要前提.
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hR24L基因转染对MCF7细胞周期的影响
目的通过观察人类DNA损伤修复基因hR24L转染对MCF7细胞增殖周期的影响,进一步了解其功能及作用机制.方法分别用正义和反义hR24L逆转录病毒表达载体(pDor-neo)重组体转染MCF7细胞,观察细胞生长速度,用Northern印迹杂交检测hR24L基因的表达情况,并用流式细胞仪检测细胞周期.结果与转染空载体的细胞相比,转染正义hR24L重组体的细胞生长较慢,其hR24L mRNA的表达增加;而转染反义hR24L重组体的细胞生长较快,其hR24L mRNA的表达则降低;转染后6h流式细胞仪检测表明,转染正义hR24L重组体的细胞G2+M期的比例(18%)明显高于其它3种细胞(6%).结论 hR24L基因的表达抑制了细胞生长,其机制是引起细胞周期阻滞,参与细胞周期调控.
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HR24L基因编码的蛋白质定位于细胞核内并 参与细胞周期的调节
目的：研究 HR24L基因编码的蛋白质在细胞内的定位及其对细胞周期的影响。方法 :PCR方法扩增 HR24L开放阅读框序列，克隆入绿色荧光蛋白载体 pEGFP C2和逆转录病毒载体 pDOR neo，分别经脂质体介导转染入 HeLa细胞。荧光显微镜观察 HeLa GFPHR24Ls细胞， Southern印迹杂交分析外源性 HR24LcDNA的整合状况。去血清处理细胞，观察 HR24L基因对细胞周期的影响。 Western印迹分析 HR24L基因对 p53表达的影响。结果 :转染获得了 HeLa GFPHR24L、 HeLa HR24Ls和 HeLa HR24La细胞。荧光显微镜观察证实 HR24L编码的蛋白质位于核内。 Southern印迹分析证实 HeLa HR24Ls和 HeLa HR24La细胞中外源性 HR24LcDNA已整合入基因组。与对照和空载体细胞相比， HeLa HR24Ls细胞中 HR24L mRNA表达升高， HeLa HR24La细胞中 HR24L mRNA表达降低。经过 24 h去血清培养后， HeLa HR24Ls细胞中 G2/M期细胞明显较其他细胞增多（ P<0.05），其他 3种细胞则无明显差别。重新加入血清培养后 24 h这种差别消失。 Western印迹分析表明， HR24L基因对 p53的表达无明显影响。结论 :HR24L基因编码的蛋白质位于细胞核内且参与细胞周期的调节。
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电离辐射对人乳腺癌MCF7细胞系hR24L基因表达的影响
目的:研究电离辐射对人类DNA修复基因hR24L表达的影响.方法:通过RT-PCR从人乳腺癌MCF7细胞总RNA中扩增hR24L的开放阅读框(ORF),经测序无突变后用γ射线照射细胞.照射后不同时间收集细胞,提取总RNA,用Northern印迹杂交分析hR24L表达变化.结果:hR24L基因的转录在电离辐射后1 h后开始上升,2 h达高峰,3 h恢复正常.结论:该基因的表达具有损伤诱导性特点,对γ射线损伤有修复作用.
