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Ⅰ～Ⅳ型登革病毒包膜蛋白B细胞中和表位的鉴定
登革病毒包膜蛋白(Dengue virus envelope protein,DENV E)是诱导中和抗体主要的蛋白,登革病毒包膜蛋白Ⅲ区(Dengue virus envelope protein domainⅢ,DENV EDⅢ)是构建DENV亚单位疫苗的主要靶标,但是其B细胞中和表位目前了解不多.我们采用两组覆盖DENV-1EDⅢ的重叠多肽(12肽和16肽)同27株针对DENV-1EDⅢ中和单抗反应,筛选DENV EDⅢ上B细胞表位.采用该方法,我们发现了一高度保守的Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位和一高度保守的DENV-1血清型特异性B细胞中和表位,分别位于DENV-1 E蛋白氨基酸残基序列第309～320位和第381～392位(Amino acid residues 309～320,and 381～392;aa 309～320和381～392).Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位在Ⅰ～ Ⅳ型DENV分离株中存在高度保守共同序列310KE-VAETQHGT"9,DENV-1E蛋白中E309、V312、A313和V320不影响蛋白抗原性.DENV-1血清型特异性B细胞中和表位(DENV-1 E蛋白氨aa 381～392)在DENV-1分离株中高度保守,在黄病毒属其它病毒中不保守.我们也发现一具有DENV-1分离株特异性的B细胞中和表位位于DENV-1 E蛋白氨基酸残基序列第329～348位.这些新发现的DENV-1 E蛋白EDⅢ上B细胞中和表位可能有助于研制新的DENV亚单位疫苗.
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甲醇诱导条件对登革病毒四型联合重组包膜蛋白Ⅲ区表达的影响
目的 探讨甲醇诱导浓度和诱导时间对登革病毒(dengue virus,DENV)四型联合重组包膜蛋白Ⅲ区(envelope domainⅢ,EDⅢ)表达的影响,以期实现该蛋白在毕赤酵母中的高效表达.方法 采用不同浓度甲醇(0.05％、0.1％、0.25％、0.5％、0.75％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、5％、7.5％)诱导表达带His标签的DENV四型联合重组EDⅢ蛋白,分别诱导18、24、30、48、72 h,样品经Western blot检测.佳条件下诱导表达的蛋白液经Ni-Agarose His亲和层析纯化后,进行10％ SDS-PAGE检测.结果 佳甲醇诱导浓度为2.5％,佳甲醇诱导时间为72 h.纯化产物经10％ SDS-PAGE检测,于相对分子质量约41 000处可见单一目的 蛋白条带,纯度为99％.结论 当甲醇浓度为2.5％,诱导时间为72 h时,可实现DENV四型联合重组EDⅢ蛋白在毕赤酵母中的高效表达.
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Ⅰ型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区中和抗体的制备与鉴定
目的 研制Ⅰ型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区(dengue virus 1 envelope protein domainⅢ,DENV-1 EDⅢ)单克隆抗体,并鉴定其血清型特异性、相对表位和中和活性.方法 采用DENV-1 EDⅢ重组蛋白为免疫原,免疫Balb/e小鼠,制备抗DENV-1 EDⅢ单抗,鉴定单抗的免疫学特性和交叉反应性,噬斑减少中和实验鉴定其中和活性,抗体与抗体间竞争抑制分析相对表位.结果 共获得抗DENV-1 EDⅢ单抗28株,其Ig亚类鉴定24株为IgG1,2株为IgG2a,2株为IgG2b,包含13株DENV-1血清型特异性单抗,9株DENV病毒特异性单抗,其它6株交叉反应性单抗以不同的方式同各型DENV EDⅢ反应,至少识别5个不同位点,其中27株抗体对不同血清型登革病毒表现出不同的中和活性.结论 成功获得了针对DENV-1 EDⅢ的特异性单抗及交叉性中和单抗,将为进一步研究登革病毒EDⅢ蛋白的结构与功能、疫苗和治疗性抗体的研发奠定基础.
