首页 > 文献资料
-
青蒿P450 cDNA基因的克隆及生物信息学分析
目的:对青蒿P450 cDNA基因进行克隆和生物信息学分析.方法:通过RT-PCR,从青蒿cDNA中克隆了1个P450基因;通过生物信息学方法,对其结构特点进行分析.结果:该P450 cDNA基因ORF为1 464 bp,编码488个氨基酸,该序列在GenBank上的登录号为DQ667171.编码蛋白是一个中等大小的A型P450,相对分子质量54.992 kDa;等电点8.83,定位于线粒体,和CYP71AV1具有很高的同源性.结论:该青蒿P450和CYP71AV1在进化和性质上很接近,可能在青蒿中执行类似功能.
-
青蒿素生物合成关键酶CYP71AV1的表达纯化和晶体培养
疟疾是一种严重危害人类健康的世界性流行疾病,在青蒿素广泛应用之前,全世界每年约4亿人次感染疟疾,至少有100万人的死亡病例.因此疟疾被世界卫生组织列为世界三大死亡疾病之一.青蒿素的发现,开创了疟疾治疗新方法,全球数亿人因这种“中国神药”而受益.紫穗槐4,11-二烯氧化酶是一种植物细胞色素P450蛋白(CYP71AV1),参与催化紫穗槐4,11-二烯生成青蒿酸的三步氧化反应,是青蒿素生物合成途径上的关键酶.作者拟通过pCW Ori(+)-CYP71AV1重组质粒在原核表达系统中的可溶性表达及蛋白纯化,采用一氧化碳差式光谱分析和基于血红素辅基的生物活性测定,验证CYP71 AV1蛋白的活性,培养该蛋白的晶体.结果表明,构建的重组基因pCW Ori(+)-CYP71AV1在大肠杆菌中得以功能性表达,经过亲和层析和凝胶过滤层析纯化得到了毫克级、有活性的目的蛋白,筛选出了重组CYP71 AV1蛋白的晶体生长条件.这些研究为解析青蒿素生物合成关键酶CYP71AV1的晶体结构,以及通过合成生物学方法批量生产青蒿素奠定了基础,同时为其他植物来源的P450蛋白的表达纯化与结晶提供参考.
-
黄花蒿cyp71av1启动子的分离及表达特性分析
目的 从黄花蒿中分离鉴定青蒿素生物合成途径关键酶--细胞色素P450单加氧酶编码基因(cyp71av1)的启动子序列并研究其表达特性,探索提高该基因表达量并进一步促进青蒿素合成的途径.方法 采用热不对称嵌套PCR法从黄花蒿DNA中分离cyp71avl 5'端非翻译区序列,构建与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因融合的植物表达载体,通过农杆菌介导转化烟草.采用GUS组织化学染色法和分光光度法分别定性和定量检测cyp71av1 5'端非翻译区序列调控GUS基因在正常条件和胁迫条件下的表达.结果 从黄花蒿中分离出长短2个cyp71av1 5'端非翻译区序列,分别获得与GUS基因融合表达的转基因烟草,均能检测到GUS活性且两者无明显差异.GUS活性定量检测结果还显示,在脱水、4℃和紫外辐射条件下,转化烟草GUS活性提高1.4～2.7倍.结论 从黄花蒿分离出的2个cyp71av1 5'端非翻译区序列都具有启动子功能,并且具有环境诱导表达特性.
关键词： 黄花蒿 CYP71AV1 启动子 青蒿素 β-葡萄糖甘酸酶(GUS)
