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探讨活血化瘀方剂对肺间质纤维化TGF-β/Smad2/3信号转导通路糖基化修饰的影响
目的:明确活血化瘀方剂是否影响TGF-β/Smad2/3信号通路中TGF-β受体糖基化修饰,用现代医学手段阐明活血化瘀方剂治疗肺间质纤维化的机制.方法:胚胎成纤维细胞WI-38细胞随机分为3组,①正常组为单独的DMEM培养;②TGF组加入浓度为10ng/mL的TGF-β 1孵育48h;③TGFH组先用10％含活血化瘀方剂血清孵育24h,然后加入10ng/mL TGF-β 1继续孵育48h.应用荧光定量PCR、免疫荧光、免疫印记技术检测各组WI-38细胞的FUT8、细胞的岩藻糖基化水平,TGF-β受体ALK5及TGF-β RⅡ的表达,应用ELISIA技术检测细胞培养液中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原纤维(COLⅠ、Ⅲ、Ⅳ)和纤维连接蛋白(FN)的变化.结果:活血化瘀方剂能明显地抑制WI-38细胞的FUT8的表达和细胞的岩藻糖基化水平,活血化瘀方剂对TGF-β受体ALK5及TGF-β RⅡ的表达无明显影响,但可以减少TGF-β 1对WI-38细胞p-Smad2/3的影响,使其表达降低.COL Ⅰ在TGF组中表达约为正常组的1.5倍,COLⅢ在TGF组中表达约为正常组的2.5倍,COLⅣ在TGF组中表达约为正常组的1倍,FN在TGF组中表达约为正常组的2.5倍,TGFH组COLⅠ、Ⅲ、Ⅳ及FN表达略高于正常组,与TGF组间具有统计学差异.结论:活血化瘀方剂可以抑制TGF-β诱导后肺成纤维细胞ALK5/TGF-βRⅡ-Smad2/3信号通路的糖基化修饰,减少Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原纤维和FN的表达.
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高糖对腹膜间皮细胞β-连环蛋白及骨桥蛋白表达的作用
目的 观察高糖对大鼠腹膜间皮细胞(rat peritoneal mesothelial cell RPMC)中β-连环蛋白(β-Catenin)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)2者mRNA及蛋白表达的影响.方法 胰蛋白酶法行RPMC的原代培养和传代,经鉴定第3代细胞融合至80%时分组.分为:正常对照组;不同浓度葡萄糖(1.5%,2.5%,4.25%) 组作用24h;2.5% 高糖作用不同时间(8,12,24,34,48 h)组,细胞免疫组织化学法检测β-Catenin蛋白在细胞上的表达情况,RealTime-RT-PCR 技术检测β-Catenin、OPN、TGF-β1mRNA的表达.ELISA法检测OPN蛋白表达.结果高糖刺激下RPMC 的β-catenin表达增加,与0 h 组比较,在8h即出现(但不具有统计学意义),12h具有统计学意义,24h达到高峰,48h 仍存在,组间差异均有统计学意义(P＜0.05);高糖可刺激RPMC OPN 的表达显著增加,呈剂量、时间依赖性(P＜0.05);TGF-β表达增加,在8h表达于较高水平,12h降低,24h达到高峰,48h仍存在,与0 h组比较,组间差异均有统计学意义(P＜0.01);高糖刺激下,β-Catenin、TGF-β1 表达显著增加,呈剂量依赖性,组间差异具有统计学意义( P＜0.05).结论 高糖通过上调β-Catenin、OPN的表达,引起腹膜损伤导致腹膜纤维化,β-Catenin、OPN参与了腹膜间皮细胞透析相关性腹膜纤维化的病理过程.
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转移生长因子-β、瘦素与骨性关节炎
骨性关节炎(osteoarthritis,OA)又称退行性关节炎,是常见的一种慢性关节炎,也是影响人类健康常见的关节疾患之一.
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转移生长因子－β对骨髓基质细胞生长影响的实验研究
目的 研究体外培养及转移生长因子-β(TGF-β))对骨髓基质细胞生长的影响。方法 抽取兔骨髓基质细胞体外培养，倒置显微镜动态观察，并在培养液中加入TGF-β。结果 从原代培养细胞(P0)中观察到细胞集落的形态有明显差异，提示骨髓基质细胞是一个由多种细胞组成的混合体。经TGF-β处理的细胞，生长速度明显增快，传30代以上仍能保持较活跃的增殖能力。而未经TGF-β处理的细胞，活跃增殖能力约只能保持10～15代，随后即发生退化。结论 TGF-β能促进骨髓基质细胞增殖并较长期保持其生物活性。
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转移生长因子-β在早期胚胎组织的表达
目的研究转移生长因子-β(Transform Growth Factor,TGF-β)在胚胎的肝、脑室、和脊髓等组织器官中增殖和分化中的作用.方法用51天的人胚胎行免疫细胞化学ABC法染色.结果在胚胎第51天,肝、脑室、和脊髓等组织器官中均有TGF-β阳性细胞存在,不同器官其阳性细胞的数量、反应强弱和表达情况有差异.结论TGF-B在人胚胎发育过程中,对肝、脑室和脊髓等组织器官的增殖分化起着自分泌和旁分泌的作用.
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利用荧光共振能量转移技术研究TGF-β/Smad3信号转导通路
转移生长因子-β1(TGF-β1)/Smad3信号转导通路与人类的多种生理病理发生机制相关,但是该信号通路中Smad3被磷酸化的时空信息仍然不完全清楚.为了动态观察活细胞生理状态下Smad3被磷酸化的过程,首先进行ECFP-Smad3-Citrine(Smad3 biosensor)融合蛋白表达载体的构建及鉴定;然后转染293T细胞并观察转染效率和融合蛋白表达情况.在荧光显微镜下,应用MetaFlour FRET 4.6软件测量TGF-β1刺激293T细胞前后Smad3 biosensor的荧光能量共振转移(FRET)的变化情况.结果显示,Smad3 biosensor转染效率达40％,融合蛋白表达成功.TGF-β1刺激293T细胞10 min后,监测到胞质内FRET值逐渐减小,青色荧光蛋白(CFP)减弱,黄色荧光蛋白变体(Citrine)增强,历时约300 s后逐渐恢复.应用FRET技术能使我们在活细胞生理状态下,实时动态监测TGF-β1/Smad3信号转导通路的过程.
