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运用单细胞聚合酶链式反应进行植入前诊断的性别鉴定
目的:建立一种高效、快速、可靠的植入前诊断的性别鉴定方法.方法: 取成人外周血单个淋巴细胞和人胚胎单卵裂球,采用多重荧光PCR和多重巢式PCR同时扩增性别识别位点Amelogenin和5号染色体上的基因IL-3.结果: 男性单个淋巴细胞荧光PCR扩增效率为72%,巢式PCR扩增效率为64.7%;女性单个淋巴细胞荧光PCR扩增效率为76%,巢式PCR扩增效率为65%,两者与供体外周血gDNA扩增结果的一致性均达100%.单卵裂球荧光PCR扩增效率为86.9%,巢式PCR扩增效率为85.7%,来源于同一胚胎的不同单卵裂球扩增结果的一致性达100%.巢式PCR与荧光PCR的扩增效率比较无显著性差异(P>0.05).结论: 巢式PCR和荧光PCR各有优劣,但荧光PCR操作简便,耗时短、灵敏度高,为今后的发展方向.
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巢式聚合酶链反应-序列特异引物法用于单卵裂球HLA-A位点分型研究
目的评价巢式聚合酶链反应-序列特异引物法(polymerase chain reaction-sequence specific primer, PCR-SSP)用于人类种植前胚胎的单个卵裂球HLA-A位点分型的准确性和可靠性.方法通过扩增HLA-A第2外显子评价单卵裂球巢式第1轮扩增的成功率,用巢式PCR-SSP法进行单卵裂球HLA-A分型.结果从10个家系的体外受精剩余胚胎中获得120个卵裂球,巢式第1轮扩增平均成功率为86.7%,其中前期家系F1～F5为78.2%,后期家系F6-F10为93.8%;对80个卵裂球进一步做SSP分型,其中11个卵裂球HLA-A第2外显子扩增失败,无分型结果,而69个卵裂球HLA-A第2外显子扩增成功,都获得分型结果.除6个卵裂球因亲本纯合无法判断是否发生缺失外,剩下63个卵裂球中,基因型与根据亲本预测的结果相符的有59个,占93.6%;显示缺少部分亲本等位基因的有3个,占4.8%;显示部分亲本等位基因重复的1个,占1.6%.结论在第1轮扩增成功的基础上,巢式PCR-SSP法用于单卵裂球HLA-A分型准确可靠,可用于临床上筛选与需要造血干细胞移植的患儿HLA型等同的胚胎.
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冻融卵裂期胚胎单个卵裂球体外发育潜能的初步探讨
目的:探讨体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗周期中冻融胚胎来源的单卵裂球体外发育潜能.方法:20例IVF-ET术生育成功后捐赠的91枚多余冷冻的胚胎,解冻后分为＜6-细胞组、6～8-细胞组和＞8-细胞组,将每枚胚胎中的卵裂球分离、取出,每个单卵裂球单独培养于一个液滴中,每24 h观察并比较各组间单卵裂球发育情况的差异.结果:6～8-细胞组单卵裂球的卵裂率、紧密化率和囊胚形成率显著高于其它各组.结论:单卵裂球体外培养发育能力及时序与其来源的胚胎发育潜力及发育阶段密切相关；辅助生殖FET周期应优先选择6～8-细胞的胚胎进行移植.
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人废弃胚胎单卵裂球体外发育潜能研究
目的:探讨体外受精治疗周期废弃胚胎来源的单卵裂球体外发育潜能.方法:收集21例患者授精培养后第3日不适于移植和冷冻的废弃胚胎共60枚,其中2.细胞期胚胎10枚.3-细胞期胚胎8枚,4-细胞期胚胎26枚,5-细胞期胚胎12枚,6-细胞期胚胎4枚.采用化学法去除透明带并分割胚胎获得单卵裂球,继续体外培养,每24 h观察卵裂球发育情况.结果:60枚胚胎共获得229枚单卵裂球.以分割取得单卵裂球日作为第1日(d 1),继续培养,其发育似乎遵循d 2分裂、d 3紧密化、d 4出现囊胚腔、d 5扩张,延续分割前的程序,但提前进入紧密化期,致使囊胚细胞数少,囊胚期体积亦比正常胚胎小.其中,4-细胞期废弃胚胎来源的卵裂球分裂率、紧密化率、囊胚形成率显著高于来自其它细胞数的单卵裂球(P＜0,05),且其大部分内细胞团(ICM)细胞的碱性磷酸酶(AKP)表达呈阳性.结论:废弃胚胎来源的单卵裂球能在体外继续发育至囊胚,发育潜能与供体胚胎发育质量密切相关,其发育似乎延续原有供体卵裂球的节律,而形成囊胚所需时间明显缩短,细胞数亦明显减少,但囊胚ICM细胞显示AKP阳性,深信其利用价值会得到进一步证实.
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小鼠4-细胞期胚胎单卵裂球体外发育潜能的实验研究
目的:探讨小鼠4-细胞期胚胎的单卵裂球(4-cell stage mice embryo derived-blastomeres,4c-MEDB)的全能性.方法:将小鼠4-细胞期胚胎分割产生单个卵裂球,在体外无透明带培养条件下,不加外源性细胞因子,观察其发育潜能及特性,并将得到的囊胚与正常囊胚进行形态学、免疫学鉴定比较,同时将4c-MEDB来源囊胚(individual blastomere derived-blastocysts,IBDB)移植到假孕母鼠子宫,观察其发育情况.结果:①体外无透明带培养条件下,4c-MEDB较正常胚胎发育滞后,囊胚获得率低;②4c-MEDB具有发育成为完整囊胚的潜能;③IBDB移植入假孕小鼠子宫后具有一定发育能力,能发育到原条期,但未获得足月妊娠.结论:在未添加外源性细胞因子的体外无透明带培养条件下,小鼠4-细胞期胚胎单卵裂球具有发育为完整囊胚的能力,所获囊胚移植入假孕小鼠子宫后可以发育到原条期.
