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5-羟色胺受体2A在大鼠肝移植术后胆管纤维化中的作用
目的 探讨5-羟色胺受体2A亚型(5-HT2A)在大鼠肝移植术后胆管纤维化中的作用及意义.方法 建立再动脉化大鼠原位肝移植模型,分以下4组.对照Ⅰ组和对照Ⅱ组,供肝分别冷保存1和12 h后行原位肝移植术;实验组:在对照Ⅱ组基础上,于术后24 h起腹腔注射选择性5-HT2A拮抗剂Ketanserin 5 mg· kg-1·d-1,直至术后4周观察期结束;假手术组(大鼠仅行开腹和关腹操作,不行肝移植).术后1d、3d、1周、2周和4周,检测胆道酶系血清碱性磷酸酶、谷氨酰转肽酶、胆红素总量含量以评价胆道功能,采用酶联免疫吸附试验检测肝组织5-HT的含量,以增殖细胞核抗原免疫组织化学染色评价胆管上皮细胞(BEC)的增殖情况.术后4周采用Masson三色染色法观察胆管周围胶原纤维的分布;以α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)作为门管区成纤维细胞(PF)转化为肌纤维母细胞(MF)的标志,进行免疫组织化学染色.术后1、2和4周,采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测肝组织内基质金属蛋白酶2(MMP2)和前胶原α1 mRNA的表达.结果 与假手术组相比,对照Ⅰ组仅术后1d胆道酶系及5-HT含量升高,术后3d少量BEC增殖,各时点肝组织MMP2和前胶原α1 mRNA的表达无显著增加;术后4周门管区未见或仅见少量胶原纤维及MF.与此相反,对照Ⅱ组和实验组术后1d胆道酶系显著升高,随后下降,术后2周时接近假手术组水平,但术后4周又显著升高,且对照Ⅱ组显著高于实验组,差异有统计学意义(P＜0.05);两组术后各时点5-HT的含量均显著高于对照Ⅰ组,峰值出现于术后1d,实验组含量有低于对照Ⅱ组的变化趋势,并在术后4周时差异有统计学意义(P＜0.05).对照Ⅱ组术后3d直至观察期结束可见BEC活跃增殖;术后2周和4周肝组织MMP2和前胶原α1 mRNA的表达显著增加;术后4周门管区可见大量胶原纤维和MF.实验组BEC增殖低于对照Ⅱ组,至术后2周和4周时差异有统计学意义(P＜0.05);术后2周和4周时肝组织MMP2和前胶原α1 mRNA的表达显著低于对照Ⅱ组,术后4周门管区胶原纤维和MF较对照Ⅱ组明显减少(P＜0.05).结论 选择性5-HT2A拮抗剂Ketanserin可延缓冷缺血时间延长引起的大鼠移植肝胆管纤维化,5-HT2A可能是潜在的肝移植后缺血性胆道疾病的干预靶点.
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Hic-5基因在胆管纤维化中的表达
目的 研究Hic-5基因在纤维化胆管组织中的作用机制.方法 随机选取30只SD大鼠,分为正常组(n=10)、假手术组(n=10)和手术组(n=10).造模21 d后,摘取大鼠胆管组织进行Masson染色,明确纤维化的胆管组织,分别采用免疫组织化学法和蛋白印迹法检测正常组、假手术组和手术组中Hic-5和TGF-β1的阳性表达,并分析其相关程度.结果 (1)Masson染色:手术组较正常组和假手术组出现明显的条梭状结构(蓝色)即纤维条索组织(P<0.001).(2)免疫组织化学法和蛋白印迹法检测均显示:Hic-5和TGF-β1在手术组中较正常组和假手术组的表达升高明显(P<0.001),而正常组和假手术组间的差异无统计学意义(P>0.05).(3)Hic-5和TGF-β1在免疫组织化学法和蛋白印迹法检测分析结果中具有明显的相关性(r=0.9898,P<0.001,r=0.7764,P<0.01).结论 (1)纤维化的大鼠胆管组织中Hic-5和TGF-β1的表达升高,说明两者与胆管纤维化的发生发展有着密切的关系;(2)Hic-5和TGF-β1在纤维化大鼠胆管组织中的表达和变化有着显著的正相关关系,说明两者可能相互作用共同导致了胆管纤维化.
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整合素αvβ6在移植肝胆管纤维化中的作用
目的 探讨整合素αvβ6在移植肝胆管纤维化中的作用,为探索新的移植物胆管病(graft cholangiopathy,GC)防治策略提供理论基础.方法 小鼠被随机分为假手术组、单纯移植组和药物干预组.假手术组不行肝移植,仅行开关腹；单纯移植组和药物干预组均采用非动脉化的小鼠原位肝移植模型,供肝冷保存时间均为12h.术后按2、4、6周3个时相点采集血液及组织标本.采用荧光实时定量PCR法测定整合素αvβ6及基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、转化生长因子-1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、转化生长因子-2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)和Ⅰ型前胶原(procollagen α1)等纤维化相关基因的mRNA表达,同时测定血清ALT、GGT、ALP以及肝组织羟脯氨酸(Hyp)的含量,并采用Masson三色染色法评估肝内胆管的纤维化情况.计量资料多组均数间的比较采用双因素方差分析,两总体均值的比较采用t检验,相关性分析采用直线回归分析.结果 严重的冷保存再灌注损伤(cold preservation/reperfusion injury,CPRI)合并动脉血供障碍可以迅速地诱发移植肝胆管纤维化.在术后第4、6周,整合素αvβ6 mRNA表达分别上调至假手术组的13.2、32.5倍,肝组织Hyp含量较假手术组分别上升87.5％、124.4％.通过特异性抑制整合素αvβ6可以明显缓解移植肝胆管纤维化,同时在一定程度上改善肝功能.结论 缺血再灌注损伤是造成移植肝胆管纤维化的重要原因之一,整合素αvβ6在这一过程中可能扮演着关键性的角色,针对整合素αvβ6的干预策略可能为GC的治疗提供新的思路.
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PPARγ激动剂拮抗TGF-β1介导的胆管纤维化的初步研究
目的 通过体外实验证实过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)激动剂抗转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)超家族介导的胆管纤维化作用.方法 原代培养人胆管成纤维细胞,分别用两种不同浓度的PPARγ激动剂比格列酮(pioglitazon,PGZ)和15-脱氧前列腺素J2(15-deoxy-△12.14-prostaglandin J2,15d-PGJ2)预处理胆管成纤维细胞后,再用致纤维化明显浓度的TGF-β1作用胆管成纤维细胞,用RT-PCR方法检测Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ,COL Ⅰ)、纤连蛋白(fibronectin,FN)、α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的mRNA表达水平.结果 PGZ和15-d-PGJ2均可以下调TGF-β1引起的COL Ⅰ、FN、α-SMA和CTGF mRNA表达水平的升高;相同浓度的PGZ与15-d-PGJ2相比,对COL Ⅰ mRNA表达的抑制作用较强,对α-SMA mRNA表达的抑制作用则较弱,而对CTGF mRNA表达的抑制作用相当.结论 PPARγ激动剂有拮抗外源性TGF-β1导致的胆管纤维化作用.
关键词： 过氧化物酶体增殖物激活受体γ 转化生长因子β1 成纤维细胞 胆管纤维化 -
肝动脉缺血对肝移植术后胆管树纤维化影响的机理及防治措施
目的 探讨肝动脉缺血对肝移植术后胆管树纤维化影响的机理及防治措施.方法 18只雄性成年实验犬被制成简易自体原位肝移植模型并随机分为肝动脉缺血组(HAI组)、肝动脉桥式置管转流组(TBB组)及对照组,每组6只.3组动物于门静脉开放后6 h、3 d和14 d时切取部分肝组织,观察肝内胆管形态学变化,用免疫组化法检测肝内胆管上皮细胞中转化生长因子(TGF)-β1蛋白的表达; 并于14 d时活杀动物,采用Western blot法测定肝内胆管组织中Smad3及磷酸化Smad3蛋白表达水平,RT-PCR法测定肝内胆管组织中α-平滑肌肌动蛋白(SMA) mRNA转录水平.结果 与对照组比较,HAI组中可观察到明显的肝内胆管上皮细胞增生,胶原蛋白沉积增多,胆管管腔狭窄; 而TBB组肝内胆管的形态学病理改变轻于HAI组.TBB组TGF-β1阳性细胞指数在门静脉开放后3 d时达到峰值,随后下降; 而HAI组则持续升高,并明显高于TBB组(P<0.05).在门静脉开放后14 d时,TBB组磷酸化Smad3蛋白表达水平和α-SMA mRNA的转录水平分别为1.04±0.13 和1.12±0.55,显著高于对照组(0.59±0.09和0.46±0.18),但低于HAI组(1.82±0.18和1.86±0.73),3组之间差异有统计学意义(P<0.05); 而3组间Smad3蛋白的表达水平差异无统计学意义(P>0.05).结论 肝动脉缺血通过对TGF-β1/Smads信号转导通路的活化,引起肝内胆管壁中胶原纤维的沉积,肌成纤维细胞转化的增多,导致胆管树纤维化的发生; 肝动脉桥式置管转流装置能够通过抑制TGF-β1/Smads信号转导通路活化来减轻肝动脉缺血引起的胆管树纤维化.
