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过氧化物酶增殖子活化受体-γ siRNA腺病毒载体的构建
目的:构建针对过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)基因的siRNA腺病毒载体.方法:依据siRNA设计原则,在PPARγ mRNA(AF013266)序列中设计2个特异性靶序列(36-54、73-91),体外合成对应发卡样DNAs,退火后先将其克隆入pSIREN-Shuttle载体,再亚克隆入pAdeno腺病毒载体,对插入序列进行DNA序列分析.结果:发卡样siRNA单链DNA寡核苷酸退火后,电泳可见明亮靶条带.连接退火寡核苷酸和pSIREN-Shuttle载体得到阳性克隆pSIREN-Shuttle-siPPARγ-36、pSIREN-Shuttle-siPPARγ-73.同源重组后得到亚克隆pAdeno-siPPARγ-36、pAdeno-siPPARγ-73,测序证实插入序列与设计序列完全一致.结论:成功构建2个靶向PPARγ基因的siRNA载体pAdeno-siPPARγ-36和pAdeno-siPPARγ-73.
关键词： RNA干扰 过氧化物酶体增殖子活化受体-γ 腺病毒载体 克隆 -
靶向PPARγ基因RNA干扰对激素抑制家兔骨髓基质细胞成骨分化的影响
目的:观察靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)基因RNA干扰阻断激素作用保持骨髓基质细胞(MSCs)成骨分化的作用.方法:选用家兔第2代MSCs,随机分为7组.对照组(C):无特殊处理;模型组(M):给予10-7 mol/L地塞米松;感染空载体组(O):给予空载体腺病毒1 × 105 U和地塞米松;感染无关siRNA组(N):给予无关序列siRNA腺病毒1×105 U和地塞米松;干扰1、2、3组(I1、I2、I3):分别给予靶向PPARγ siRNA 1、2、3腺病毒1 × 105 U和地塞米松.7d后采用RT-PCR技术检测各组细胞中PPARγ mRNA和核心结合因子 al(Cbfal) mRNA表达.14 d后测定各组培养液骨钙素含量和细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性.结果:M组、O组和N组PPARγ mRNA呈高表达,cbfal mRNA呈低表达,骨钙素含量和ALP活性均下降,与C组比较差异均有统计学意义(P均<0.05).I1组、I2组、I3组PPARγ,mRNA呈低表达,Cbfal mRNA呈高表达,骨钙素含量和ALP活性均接近C组,与C组比较差异均无统计学意义(P均>0.05).结论:靶向PPARγ基因RNA干扰能够阻断激素作用,下调PPARγ基因表达,上调Cbfal基因表达,保持细胞的正常成骨分化.
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靶向PPARγ基因siRNA腺病毒对乙醇抑制家兔骨髓基质细胞成骨分化的影响
目的:观察靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)基因siRNA腺病毒阻断乙醇作用、保持骨髓基质细胞(MSCs)成骨分化的作用.方法:选用家兔第2代MSCs,随机分为7组.对照组(N):无特殊处理;模型组(M):给予0.09 mol/L乙醇;感染空载体组(CO):给予空载体腺病毒1×105 U和乙醇;感染无关siRNA组(C1):给予无关序列siRNA腺病毒1×105 U和乙醇;干扰1、2、3组(S1、S2、S3):分别给予靶向PPARγ siRNA 1、2,3 腺病毒1×105 U和乙醇.7 d后采用RT-PCR技术检测MSCs内PPARγ Mrna和骨钙素(Osteocalcin) Mrna表达,14 d测定细胞碱性磷酸酶(ALP)活性.结果:M组、C0组、C1组PPARγ Mrna呈高表达,Osteocalcin Mrna 呈低表达,ALP活性下降,与N组比较差异均有统计学意义(P均<0.05).S1组、S2组、S3组PPARγ Mrna 呈低表达,Osteo-calcin Mrna 呈高表达,ALP活性升高,与M组、C0组、C1组比较差异均有统计学意义(P均<0.05),与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:靶向PPARγ基因siRNA腺病毒能够阻断乙醇作用,下调细胞内PPARγ基因表达和上调Osteocaloin基因表达,保持MSCs成骨分化.
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靶向PPARγ基因RNA干扰对乙醇诱导家兔骨髓基质细胞成脂分化的影响
目的:观察靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)基因RNA干扰阻断乙醇诱导骨髓基质细胞的成脂分化效应.方法:选用家兔第2代骨髓基质细胞,随机分为7组.对照组(N):无特殊处理;模型组(M):给予0.09 mol/L乙醇;感染空载体组(CO):给予空载体腺病毒1×105U和乙醇;感染无关siRNA组(C1):给予无关序列siRNA腺病毒1×105U和乙醇;干扰1、2、3组(S1、S2、S3):分别给予靶向PPAR-γ siRNA 1、2、3 腺病毒1×105U和乙醇.7d后采用RT-PCR技术检测MSCs内PPARγmRNA表达,14 d后测定MSCs内甘油三酯含量,21d后MSCs苏丹Ⅲ染色,计数脂肪细胞.结果:M组、C0组、C1组PPARγ mRNA呈高表达,脂肪细胞数增多,细胞甘油三酯含量升高.与N组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);S1组、S2组、S3组PPARγ mRNA呈低表达,脂肪细胞数少,细胞内甘油=三酯含量稍高,与M组、CO组、C1组比较差异均有统计学意义(P均<0.05),与N组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:靶向PPARγ,基因RNA干扰能够有效地阻断乙醇诱导的骨髓基质细胞中PPARγmRNA高表达和成脂分化.
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靶向 PPARγRNA 干扰对激素诱导家兔骨髓基质细胞成脂分化的影响
目的:观察靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)RNA干扰抑制激素诱导骨髓基质细胞成脂分化的作用.方法:选用家兔第2代骨髓基质细胞.随机分为6组:模型组(M组:给予10-7 mol/L地塞米松),干扰1、2、3组(S1组、S2组、S3组:分别给予siRNA 1、2、3腺病毒1 × 106 U和10-7 mol/L地塞米松),感染无关siRNA gl(C组:给予siRNA4腺病毒1×106 U和10-7 mol/L地塞米松),对照组(N组:不给予siRNA腺病毒和地塞米松).苏丹Ⅲ染色.光镜下进行脂肪细胞计数,并采用RT-PCR方法检测细胞内PPARγ Mrna的表达.结果:处理并培养细胞3 d,S1组、S2组、S3组细胞内PPARγ,Mrna表达水平低于M组、C组(P<0.05),且与N组比较差异无统计学意义(P>0.05).处理细胞14 d后.S1组、S2组、S3组中分化为脂肪细胞的数量少于M组和C组(P<0.05),且与N组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:siRNA能够有效阻断激素诱导的骨髓基质细胞中PPARγ/Mrna表达及其成脂分化.
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联合调控CGRP和PPARγ基因的重组载体构建与鉴定
目的 构建与鉴定联合调控降钙素基因相关肽(CGRP)和过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)基因的重组载体.方法 将CGRP基因完整ORF克隆,设计其两端带MluI酶切位点,与TGFP融合蛋白表达单元间用一段柔性链连接,CGRP基因ORF cDNA纯化后与线性化pGFP-V-RS载体连接;按照siRNA的设计原则,设计靶向PPARγ的siRNA寡核苷酸靶序列,将发卡样siRNA寡核苷酸靶序列退火后克隆入线性化pGFP-V-RS载体;再在此载体中克隆入CGRP ORF cDNA片段.进而将此3个质粒做酶切及测序鉴定.结果 表达CGRP基因的pG-FP-V-RS-exCGRP、沉默PPARγ基因表达的pGFP-V-RS-siPPARγ和表达CGRP且同时沉默PPARγ的pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP,经酶切及测序鉴定的结果与设计均完全一致.结论 成功构建出联合调控CGRP表达和沉默PPARγ的双基因重组栽体.
关键词： 降钙素基因相关肽 过氧化物酶体增殖子活化受体-γ 载体 联合调控 -
促进成骨与抑制成脂基因共转染NIH3T3成纤维细胞中的表达
目的：检测降钙素基因相关肽基因（CGRP）和沉默过氧化物酶体增殖子活化受体-γ（PPARγ）共转染NIH3T3成纤维细胞中的表达。方法培养 NIH3T3成纤维细胞，收集细胞随机分为五组，正常组：正常培养细胞，不做特殊处理，作为正常对照；空载体组：仅用空载体 pGFP-V-RS 质粒转染细胞，作为阴性对照组；CGRP 组：用重组载体 pGFP-V-RS-exCGRP 质粒转染细胞；siPPARγ组：用重组载体 pGFP-V-RS-siPPARγ质粒转染细胞；双基因组：用重组双基因载体 pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP 质粒转染细胞。电转染成功后，继续培养细胞48 h，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）与蛋白质免疫印迹法（Western blot）分别检测各组细胞内 PPARγ、CGRP mRNA 与蛋白的表达。结果双基因组中 CGRP 基因呈高表达，明显高于正常组、空载体组、siPPARγ组，差异均有统计学意义（P ＜0.05）；与 CGRP 组中 CGRP 基因表达量相近，差异未见统计学意义（P ＞0.05）。双基因组细胞中 PPARγ基因呈低表达，明显低于正常组、空载体组、CGRP 组，差异均有统计学意义（P ＜0.05）；与 siPPARγ组细胞中 PPARγ基因表达量相似，差异未见统计学意义（P ＞0.05）。结论促进成骨基因和抑制成脂基因共转染 NIH3T3成纤维细胞，能够上调细胞中 CGRP 基因表达，同时下调 PPARγ基因表达。
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微小RNA-27a靶向调控过氧化物酶体增殖子活化受体-γ和骨形态发生蛋白-2对激素诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化的影响
目的 检测微小RNA(miRNA,miR)-27a调控过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPAR-γ)和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化的影响.方法 将培养的40只大鼠BMSCs,随机分4组,正常对照组:细胞不作特殊处理;模型组:细胞给予1×10-7 mol/L地塞米松;无关序列组:将无关序列基因电转入细胞,给予1×10-7 mol/L地塞米松;实验组:将具有双向靶向作用的miR-27a电转入细胞,给予1×10-7 mol/L地塞米松.采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)技术测定PPAR-γ和BMP-2 mRNA的相对表达量.结果 处理细胞7d时,实验组细胞中PPAR-γmRNA的相对表达量(1.203±0.111)较模型组(1.877±0.225)、无关序列组(1.913±0.195)明显降低(P＜0.05),近似于正常组(1.000)且与其差异无统计学意义(P＞0.05).实验组细胞中BMP-2 mRNA的相对表达量(0.832±0.105)较模型组(0.455±0.051)、无关序列组(0.422±0.038)明显升高(P＜0.05),近似于正常组(1.000)且与其差异无统计学意义(P＞0.05).结论 miR-27a能够有效抑制PPAR-γ表达,维持BMP-2表达.
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沉默过氧化物酶体增殖子活化受体γ表达降钙素基因相关肽基因重组载体的构建与鉴定
目的 构建与鉴定沉默过氧化物酶体增殖子活化受体γ(PPARγ)同时表达降钙素基因相关肽(CGRP)基因重组载体.方法 选用pGFP-V-RS载体,将PPARγ小干扰RNA(siRNA)寡核苷酸靶序列连接入pGFP-V-RS载体,酶切鉴定及测序正确后得到重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ;将CGRP片段与Mlu Ⅰ酶切,并与末端羟基化的线性质粒pGFP-V-RS重组连接,得到重组载体pGFP-V-RS-exCGRP.将获取的CGRP基因片段连接入线性化重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ,酶切鉴定及测序正确后得到重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP.收集第3代HEK-293细胞,将细胞分为4组:CON组:转染空载体pGFP-V-RS质粒,作为对照；SI组:转染重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ质粒；EX组:转染重组pGFP-V-RS-exCGRP质粒；DOU组:转染重组双基因载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP质粒.每组电极杯中加入5x106个细胞,并分别加入上述质粒2.5μl,给予直流电低压脉冲1次,时间15 ms.培养48 h后收集各组细胞,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)与Western blot检测细胞内PPAR、CGRP mRNA及蛋白的表达.结果 重组双基因载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP经酶切鉴定及测序结果与设计完全一致.电转染HEK-293细胞后,DOU组细胞PPARγ基因呈低表达,PPARγmRNA与其蛋白的相对表达量为0.036±0.003、0.108 ±0.031,与EX组(0.156±0.014、0.778±0.103)及CON组(0.148±0.014、0.742 ±0.143)比较,差异有统计学意义(P＜0.05),与SI组(0.054±0.005、0.135 ±0.039)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).DOU组细胞CGRP基因呈高表达,CGRP mRNA与其蛋白的相对表达量为1.144±0.106、1.244±0.184,与SI组(0.320±0.030、0.370±0.089)及CON组(0.444 ±0.041、0.274±0.062)比较,差异有统计学意义(P＜0.05),与EX组(1.021 ±0.095、1.221±0.181)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建出沉默PPARγ基因并表达CGRP基因的重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP,能够有效阻断PPARγ基因表达,同时促进CGRP基因表达.
关键词： RNA干扰 过氧化物酶体增殖子活化受体-γ 降钙素基因相关肽 重组载体 -
靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ基因siRNA腺病毒载体的构建与鉴定
目的 构建、鉴定靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPAR-γ)基因的siRNA腺病毒载体.方法 遵循siRNA片段的设计原则,依据GenBank中PPARγ基因(AF013266)的序列,设计3个特异性靶序列(36～54位、73～91位和404～422位);体外合成对应发卡样DNA片段,经退火后,将其克入pSIREN-Shuttle载体,通过PCR和I-Ceu I和PI-Sce I酶切鉴定后,再亚克隆入pAdeno-X腺病毒载体.对插入序列进行DNA序列分析.结果 发卡样siRNA单链DNA寡核苷酸退火后,电泳可见明亮靶条带;PCR扩增和酶切鉴定得到阳性克隆pSIREN-Shuttle-siPPARγ-1、pSIREN-Shuttle-siPPARγ-2和pSIREN-Shuttle-siPPARγ-3.亚克隆重组腺病毒载体pAdeno-X siPPARγ1、pAdeno-X-siPPART-2和pAdeno-X-siPPARγ-3,经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致.结论 成功构建3个靶向PPARγ基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步的基因治疗研究奠定了实验基础.
关键词： RNA干扰 过氧化物酶体增殖子活化受体-γ 腺病毒载体 -
地塞米松对人骨髓间充质干细胞成脂分化的基因调控
目的 观察地塞米松对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)内成脂转录因子PPARγ mRNA和成骨基因Osteocalcin mRNA表达的影响.方法 取健康自愿者骨髓,通过梯度离心、贴壁分离培养获得hBMSCs.传代培养第2代hBMSCs 8 d,随机分为两组,实验组给予10-7 mol/L地塞米松,对照组不给予地塞米松,5 d后收集细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测两组细胞中PPARγ mRNA和Osteocalcin mRNA的表达.结果 用地塞米松处理细胞5 d,RT-PCR检测结果显示,实验组hBMSCs内PPARγmRNA呈高表达,对照组hBMSCs内PPARγ mRNA呈低表达,两组差异有统计学意义(P＜0.01).实验组hBMSCs内Osteocalcin mRNA呈低表达,对照组hBMSCs内Osteocalcin mRNA呈高表达,两组间差异有统计学意义(P＜0.01).结论 地塞米松能够调控hBMSCs内成脂转录因子高表达,而抑制其成骨表达,这可能与激素性骨坏死的发生机制有关.
关键词： 人骨髓间充质干细胞 过氧化物酶体增殖子活化受体-γ 骨钙素 地塞米松 -
腺病毒穿梭载体介导RNA干扰对激素诱导兔骨髓间充质干细胞成脂分化的作用
目的 观察腺病毒穿梭载体介导RNA干扰对激素诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂分化的影响.方法 选取新西兰兔制备BMSCs并随机分为6组,RNA干扰1组、2组和3组(S1、S2和S3)；无关序列组(Con)；模型组(M)；正常对照组(N).加入激素终质量浓度为1×10-7 mol/L地塞米松.将重组腺病毒穿梭载体转染细胞,采用TaqMan逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot方法分别检测各组BMSCs内过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)mRNA及其蛋白表达,测定细胞甘油三酯含量,用苏丹Ⅲ染色细胞并计数脂肪细胞.结果 处理细胞7d时,S1、S2、S3、Con、M、N组中,PPARγ mRNA相对表达值分别为0.406±0.012、0.401±0.009、0.410±0.042、0.621 ±0.045、0.628±0.008、0.399 ±0.014,PPARγ Western blot灰度扫描值分别为0.246±0.027、0.235±0.015、0.257±0.025、0.800±0.017、0.793 ±0.019、0.244 ±0.010. S1、S2、S3、N组中PPARγ mRNA及其蛋白表达均明显低于M、Con组,差异均有统计学意义(P＜0.05),S1、S2、S3组和N组之间差异无统计学意义(P＞0.05).S1、S2、S3、N组中脂肪细胞计数、甘油三酯含量均明显低于M、Con组,差异均有统计学意义(P＜0.05),S1、S2、S3组和N组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 靶向PPARγ基因的腺病毒穿梭载体介导RNA干扰能够有效地抑制激素诱导的BMSCs成脂分化.
关键词： RNA干扰 腺病毒穿梭载体 激素 过氧化物酶体增殖子活化受体-γ 成脂分化
