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慢病毒介导的shRNA靶向干扰I2PP2A胃癌稳定细胞株的建立
背景与目的：蛋白磷酸酶2A抑制剂-2(inhibitor 2 of protein phosphatase 2A，I2PP2A)在包括胃癌的多种肿瘤中过度表达，提示其可能在胃癌的发生中发挥重要作用。为进一步探讨I2PP2A的功能及其在胃癌发生中的作用，建立稳定抑制I2PP2A基因表达的人胃癌BGC823细胞株。方法：筛选出I2PP2A基因的RNA干扰(RNA interference，RNAi)有效靶序列，合成靶序列的Oligo DNA并构建pGLV2_shRNA_I2PP2A慢病毒载体，酶切和测序鉴定正确后，经病毒包装，感染BGC823细胞，经嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株，通过实时定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)和蛋白[质]印迹法(Western blot)鉴定I2PP2A的表达。结果：重组慢病毒质粒经测序鉴定正确；RT-PCR和Western blot证实干扰I2PP2A后，BGC823细胞株中I2PP2A表达水平明显降低，抑制率约为90%。结论：成功构建了I2PP2A shRNA慢病毒表达载体，建立了稳定抑制I2PP2A基因表达的人胃癌BGC823细胞株，为进一步研究I2PP2A在胃癌发生中的作用提供了可靠的细胞模型。
关键词： 蛋白磷酸酶2A抑制剂-2 胃癌 慢病毒 稳定细胞株 -
沉默I2PP2A基因对胃癌BGC-823细胞增殖和迁移能力的影响
目的 探讨siRNA沉默I2PP2A基因表达对人胃癌BGC-823细胞增殖和迁移的影响及其可能的分子机制.方法 脂质体转染法将靶向I2PP2A的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)转染BGC-823细胞;Real-time RT-PCR和Western blot观察转染后胃癌BGC-823细胞I2PP2A mRNA和蛋白表达的变化;WST-1法和Transwell小室分别检测各组细胞增殖和细胞迁移能力的变化;后采用蛋白质印迹分析法检测三组胃癌细胞中cyclin D1和MMP-9蛋白的表达.结果 转染I2PP2A siRNA后胃癌BGC-823细胞的I2PP2A mRNA及蛋白表达明显受抑制;I2PP2A mRNA和蛋白表达下调抑制胃癌BGC-823细胞的增殖和迁移,并降低cyclinD1和MMP-9蛋白的表达.结论 I2PP2A表达下调介导的胃癌细胞增殖抑制和迁移降低可能与cyclin D1和MMP-9表达下调密切相关,I2PP2A可能成为胃癌治疗的新靶点之一.
关键词： 蛋白磷酸酶2A抑制剂-2 小分子干扰RNA 胃癌 细胞增殖 细胞迁移 -
胃癌组织中I2PP2A基因表达量及基因沉默对胃癌细胞恶性生物学的影响
目的:研究胃癌组织中蛋白磷酸酶2A抑制剂-2(I2PP2A)基因表达量及基因沉默对胃癌细胞恶性生物学的影响.方法:采集胃癌患者的胃癌组织及癌旁正常组织,培养胃癌细胞株BGC-823并转染I2PP2A的siRNA,检测组织标本中I2PP2A的mRNA含量和蛋白含量;检测细胞样本中的凋亡细胞比例、不同细胞周期比例、Cyclin B2、Cyclin D1、CDK1、Bcl-2、Survivin的蛋白含量.结果:胃癌组织中I2PP2A的mRNA含量和蛋白含量均高于癌旁正常组织;转染I2PP2A-siRNA后,胃癌细胞的G0/G1期细胞比例、凋亡细胞比例高于阴性对照组,S期细胞和G2/M期细胞比例低于阴性对照组,Cyclin B2、Cyclin D1、CDK1、Bcl-2、Survivin的蛋白含量均低于阴性对照组.结论:胃癌组织中I2PP2A基因的表达量异常增多;沉默I2PP2A基因能够通过抑制Cyclin B2、Cyclin D1、CDK1、Bcl-2、Survivin的表达来诱导胃癌细胞凋亡并使细胞周期停滞于G0/G1期.
关键词： 胃癌 蛋白磷酸酶2A抑制剂-2 基因沉默 恶性生物学行为
