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G250基因沉默诱导肾癌786-0细胞凋亡
目的 观察沉默G250基因对肾癌786-0细胞凋亡的影响.方法 构建靶向G250的siRNA表达质粒pshRNA-G250并转染肾癌786-0细胞,TUNEL法和流式细胞仪检测G250基因沉默后肾癌786-0细胞(命名786-0/si-G250-b)的凋亡率,以转染空质粒的细胞(命名786-0/si-G250-0)为对照.结果 TUNEL法显示786-0/si-G250-b和786-0/si-G250-0细胞凋亡率分别为(21.537±3.552)%、(6.590±1.167)%,(t=6.925,P=0.002),流式细胞仪检测示细胞凋亡率分别为(33.033±2.914)%、(9.133±1.115)%,(t=13.266,P=0.000).结论 沉默G250基因的表达可诱导肾癌786-0细胞的明显凋亡.
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千金子对表达人G250基因小鼠renca细胞增殖的影响
目的 观察中药千金子对表达人G250基因小鼠renca细胞增殖的影响.方法 利用DNA重组技术将成功扩增的人G250基因编码区序列定向插入到pRNAT-U6.1/Neo质粒真核表达载体中,得到重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-G250,将该质粒转染renca小鼠细胞,经G418筛选获得抗性单克隆,扩大培养后经Western印迹鉴定人G250基因的表达.将该细胞在不同浓度含千金子二萜醇(111μg/ml、333μg/ml、1000μg/ml、3000μg/ml、9000μg/ml)的培养基中培养,MTT法观察千金子二萜醇对表达人G250基因小鼠renca细胞体外增殖情况的影响.结果 与空白对照组相比,24 h后实验组细胞增殖速度减慢,并随浓度增加增殖速度减慢越明显,空白组与3000μg/ml及9000μg/ml浓度组比较差异有明显统计学(P=0.006,P=0.000).结论 中药千金子使表达人G250基因小鼠renca细胞增殖能力降低,renca细胞体外生长被显著抑制.
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G250基因siRNA表达载体的构建与鉴定
目的 构建肾癌相关抗原G250小分子干扰RNA(siRNA)表达载体,通过抑制G250基因的表达,探索肾癌基因治疗的新途径.方法 根据基因库上的肾癌相关抗原G250 mRNA序列,设计并合成两端含有酶切位点的75个碱基的寡核苷酸链.寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接至线性化的质粒pRNAT-U6.1/Neo中,构建成重组质粒(命名为pshRNA-0250a,pshRNA-G250b),进行酶切及序列鉴定.结果 pshRNA-G250表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA序列一致.结论 成功构建pshRNA-G250表达载体,为进一步的研究及探索.肾癌基因治疗奠定了基础.
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siRNA抑制肾癌786-0细胞G250基因的表达
目的 观察小干扰RNA(siKNA)对肾癌786-0细胞株G250基因表达的抑制效果,以建立稳定的RNA干扰(RNAi)技术及用于进一步对G250基因的研究.方法 体外合成4条针对G250基因的siRNA和1条阴性对照序列,并利用载体pRNAT-U6.1/Neo构建重组质粒.测序鉴定后,以脂质体介导转染人肾癌786-0细胞株;分别应用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹技术测定G250 mRNA和蛋白的表达情况.结果 DNA测序和酶切鉴定表明针对G250基因的siRNA表达载体构建成功.4条siRNA分别使G250mRNA的表达降低了35.56%、49.27%、45.88%和65.13%,G250蛋白的表达量也相应降低.结论 siRNA可有效抑制786-0细胞株中G250基因的表达,满足下一步实验的需要.
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不同浓度千金子对G250基因高表达肾癌Renca细胞株Livin蛋白表达的影响研究
目的 观察不同浓度千金子对G250基因高表达肾癌Renca细胞株Livin蛋白表达的影响.方法 将125只大鼠分为正常对照组、模型对照组、高剂量千金子治疗组、中剂量千金子治疗组以及低剂量千金子治疗组,每组大鼠25只.正常对照组正常饲养,其余各组采用皮下注射法构建肾脏移植瘤模型.高剂量千金子治疗组、中剂量千金子治疗组以及低剂量千金子治疗组分别于成瘤5 d后连续给予千金子治疗,注射浓度分别为20 mg/mL、10 mg/mL以及2.5 mg/mL,剂量为200 mg/kg,1次/d,连续15 d接受千金子治疗.正常对照组与模型对照组造模后给予注射等剂量生理盐水.比较各组大鼠抑瘤率、G250基因蛋白、Livin基因蛋白的表达.结果 与模型对照组相比,高、中、低剂量千金子治疗组5~25 d平均抑瘤率较高(P<0.05),且各组平均抑瘤率呈逐渐增高趋势;与中剂量千金子治疗组以及低剂量千金子治疗组相比,高剂量千金子治疗组平均抑瘤率较高(P<0.05).与正常对照组相比,模型对照组,高、中、低剂量千金子治疗组肾脏组织中Livin基因表达水平较低(P<0.05);G250基因表达水平较高(P<0.05);与中剂量千金子治疗组以及低剂量千金子治疗组相比,高剂量千金子治疗组Livin基因表达水平较高(P<0.05);G250基因表达水平较低(P<0.05).结论 高浓度千金子对肾癌Renca细胞株具有良好的抑制作用,可能与下调G250基因表达,上调Livin蛋白表达相关.
关键词： 千金子 G250基因 肾癌Renca细胞株 livin蛋白
