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用Psi2STK/GCV对鼠C6神经胶质瘤细胞作用的初步研究
目的研究利用基因工程包装细胞进行基因转导和药物治疗相结合来治疗脑胶质瘤的可行性.方法利用分子生物学方法构建了逆转录病毒载体STK及基因工程包装细胞psi2STK,用psi2STK细胞和丙氧鸟苷(GCV)结合对胶质瘤细胞进行了基因治疗研究.结果C6胶质瘤细胞和基因工程包装细胞与不同浓度的丙氧鸟苷(GCV)一起培养,未感染的细胞比感染的细胞对丙氧鸟苷(GCV)更为敏感.结论通过体外实验证实:逆转录病毒转导HSV-TK基因在培养C6胶质瘤细胞中,提高了其对GCV的敏感性.
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Psi2STK/GCV与鼠C6神经胶质瘤细胞的相互作用
目的:研究利用基因工程包装细胞进行基因转导与药物相结合来治疗脑胶质瘤的可行性.方法:利用基因转导技术及分子生物学方法构建了逆转录病毒载体STK及基因工程包装细胞psi2STK,并利用psi2STK细胞和丙氧鸟苷(GCV)结合对胶质瘤细胞进行了离体的基因治疗研究.结果:实验组C6BpBAG+psi2STK由于有psi2STK细胞的存在,对GCV的敏感性比对照组C6BpBAG+psi2STK明显增强.结论:通过体外实验证实了逆转录病毒转导HSV-TK基因,在培养C6胶质瘤细胞中,提高了其对GCV的敏感性.
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可调控自杀基因的SCID小鼠乳腺癌基因治疗的研究
目的: 探讨经强力霉素(Dox)诱导后,丙氧鸟苷(GCV)对SCID小鼠乳腺癌的调控性治疗作用.方法: 重组逆转录病毒载体pRevTRE/HSVtk与pRevTet-On共转染乳腺癌细胞MCF-7,接种SCID小鼠成瘤后,腹腔内分别注射生理盐水(NS)、GCV及Dox+GCV治疗15 d.观测肿瘤体积和组织病理改变及用RT-PCR分析肿瘤组织有无HSVtk的表达.结果: 乳腺癌SCID小鼠经Dox+GCV治疗15 d后,肿瘤体积明显减小,生长受抑,组间比较有显著性差异(P<0.05);HE染色发现治疗组肿瘤有局部坏死,炎性细胞浸润.RT-PCR结果显示Dox诱导后肿瘤组织HSVtk表达较明显.结论: 在Dox的诱导作用下,GCV对可调控性自杀基因乳腺癌SCID小鼠有显著治疗作用.
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含HSV-TK基因的真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达
目的构建AFP增强子CMV启动子调控下的HSV-TK 真核表达质粒用于肝细胞癌的靶向基因治疗.方法采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增AFP基因增强子小的功能片断,插入pcDNA3.1-LUC质粒的Bgl II位点,从而构建重组表达质粒pAFP-LUC.HSV-TK cDNA 全长序列替换pAFP-LUC质粒中EcoRI位点的Luciferase cDNA全序列构建重组表达质粒pAFP-TK.质粒pAFP-LUC采用脂质体法转染AFP阳性的肝癌细胞系HepG2及AFP 阴性的非肝癌细胞系HeLa,用Luciferase分析试剂盒分析Luciferase的表达情况.结果 PCR扩增所得AFP增强子片段的长度和序列通过琼脂糖凝胶电泳、DNA测序得到证实.采用限制性内切酶酶切及PCR方法证实质粒pAFP-LUC中插入的AFP增强子大小、位置及方向均正确.酶切后凝胶电泳分析证实HSV-TK已成功地定向克隆入真核表达载体中.Luciferase报道基因的表达受AFP 增强子的调控,在AFP阳性肝癌细胞HepG2中高效表达,而在AFP阴性的HeLa细胞中表达很低,这种差异具有显著性,P＜0.05. 结论 AFP增强子CMV启动子调控的HSV-TK真核表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的特异性表达为肝细胞癌的靶向基因治疗提供了实验基础.
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HyTK基因转导联合丙氧鸟苷对鼠膀胱癌细胞的体外杀伤作用
目的探索HyTK基因转导丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV)对鼠膀胱癌细胞的影响.方法脂质体介导法将PL(HyTK)SN质粒转染PA317细胞,潮霉素B筛选,直到出现抗性克隆,扩增培养,NIH3T3细胞测定病毒滴度,用逆转录病毒上清液感染T739细胞,潮霉素B筛选,直到出现抗性克隆,扩增培养,命名为T739-TK.RT-PCR对T739-TK细胞进行鉴定.然后观察其在体外膀胱癌细胞的杀伤作用.结果 RT-PCR证实HyTK基因已插入T739细胞并有其mRNA的表达,经不同浓度GCV处理后的T739-TK细胞均表现出有杀伤作用,而T739细胞在各个剂量的GCV作用下生长均良好.结论 GCV对转导了HyTK基因的T739细胞有显著杀伤作用.
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HSV-TK/GCV系统治疗鼠膀胱癌细胞T739旁观者效应的实验研究
目的为探讨HSV-TK/GCV系统治疗鼠膀胱癌细胞T739的旁观者效应.方法台盼蓝染色计数法对GCV单独作用T739-TK细胞、T739细胞或其两者按不同比例混合在不同容积等情况下的杀伤作用进行研究.结果 HSV-TK/GCV系统有效的杀伤T739-TK细胞,且这种作用有明显的旁观者效应,旁观者效应的强弱与T739-TK细胞所占比例以及细胞间接触程度成正相关.结论 HSV-TK/GCV系统不仅能有效的杀伤T739-TK细胞,而且对T739细胞有明显的旁观者效应.
