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窖蛋白1在无血清状态下诱导FBJ细胞死亡
目的 研究无血清状态下,FBJ-S1细胞较FBJ-LL细胞更易死亡的原因.方法 用细胞活性检测法分析细胞的活性,分别用HPTLC法、逆转录PCR法和免疫印迹法检测细胞中GD1a和窖蛋白1(caveolin-1)的含量.结果 研究表明,在无血清培养基培养条件下,富含神经节苷脂GM3和GD1a的低转移性的FBJ-S1小鼠骨肉瘤细胞趋向死亡,但对含有几乎相同量GM3而无GD1a表达的高转移性的FBJ-LL细胞的生长却未见明显影响.同时发现:a.FBJ-S1细胞富含窖蛋白1,而FBJ-LL细胞中窖蛋白1表达量则较低.b.利用小干扰基因沉默技术在FBJ-S1细咆中沉默窖蛋白1的表达,结果使细胞存活率升高;c.使用GD1a处理FBJ-LL细胞导致其趋向死亡,通过免疫印迹法检测窖蛋白1发现其蛋白表达量增加.结论 在无血清培养条件下,窖蛋白1诱导FBJ细胞的死亡.
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GD1a对基质金属蛋白酶-9在不同细胞类型中表达的调控作用
目的 在不同的细胞类型中,检测神经节苷脂GD1a是否抑制基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达.方法 采用逆转录PCR法和酶谱法检测MMP-9及MMP-2的表达.结果 在鼠黑色素瘤B16细胞中,神经节苷脂GD1a促进MMP-9的表达,而在小鼠肺癌Lewis细胞、人单核细胞THP-1及人子宫颈癌HeLa细胞中,神经节苷脂GD1a降低MMP-9的表达.在上述细胞中,神经节苷脂GD1a不影响基质金属蛋白酶MMP-2的表达;肿瘤坏死因子TNF-α在这几种细胞中均能促进MMP-9的表达,但对MMP-2无影响;在B16细胞中,GD1a通过胞窖膜介导信号传递,并且主要通过ERK促进MMP-9的表达,而在Lewis细胞中,GD1a不通过胞窖膜介导信号传递,但部分通过p38、ERK和JNK抑制MMP-9表达.结论 在不同的细胞类型中,神经节苷脂GD1a能够激活不同的信号转导途径.
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在无血清条件下TNFα通过Pkn1和MAPK-Erk通路对FBJ细胞生长的调控作用
目的 研究肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor OL,TNFα)在无血清条件下作为生长因子促进FBJ细胞生长的信号通路.方法 用细胞活性检测法分析细胞的活性;分别用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcriptional-polymerase chain reaction,RT-PCR)法和免疫印迹法检测细胞中TNFα的表达以及胞外信号调节激酶(extracdlular signal-regulated kinase,Erk)、p38有丝分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)的磷酸化水平.结果 在无血清培养基培养条件下,经TNFα(10 μg·L-1)处理的FBJ细胞明显对抗无血清条件下诱发的细胞死亡,TNFαsensc cDNA转染的FBJ-LL和FBJ-S1细胞均能提高其在正常培养基以及无血清培养基中的生长速度,TNFα是FBJ细胞中重要的生长因子之一;蛋白酶N1(protein kinase N1,Pkn1)siRNA可明显沉默目的 基因Pkn1的表达,同时降低TNFα的含量;Pkn1沉默的细胞在无血清条件下的生长明显被抑制;TNFα处理的细胞能迅速刺激Erk的磷酸化,Erk沉默的FBJ-LL细胞的生长速度明显降低,TNFα通过Erk信号通路诱发细胞生长;TNFα亦能诱导另一有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族p38的磷酸化;神经节苷脂GD1a可降低TNFα在FBJ细胞中的表达,TNFα诱发的无血清条件下的生长速度也被神经节苷脂GD1a抑制.结论 在无血清条件下.TNFα通过Pkn1和MAPK-Erk通路调控小鼠骨肉瘤FBJ细胞的生长.
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单唾液酸四己糖神经节苷脂钠有关物质测定方法的研究
目的:建立单唾液酸四己糖神经节苷脂钠(GM1)有关物质的检测方法.方法:采用COSMOSIL 5C8-MS柱(250 mm×4.6mm,5μm),以乙腈-0.01mol·L-1四丁基硫酸氢铵(80∶ 20)为流动相,流速1.0 mL·min-1,在205 nm波长处,应用外标法对GM1中已知杂质GD1a和GD3进行检查,其他未知杂质用不加校正因子的主成分自身对照法进行检查.结果:GD1a和GD3在15 ～ 240 μg·mL-浓度范围内线性关系良好,相关系数均为0.9999;检测限分别为1.40 μg和1.41 μg;定量限分别为4.61μg和4.60 μg；方法重复性的RSD分别为0.45％和0.51％；该方法与现行标准的对比测定结果显示,现行标准测得的杂质总量和总数目明显低于该方法.结论:本方法专属性强,灵敏度高,精密度好,可用于质量控制以及GM1原料药中有关物质的研究.
