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TP53INP1高表达在砷剂杀伤肺腺癌细胞中的增敏作用
目的 构建TP53INP1高表达的肺腺癌A549细胞,初步研究提高TP53INP1的表达能否提高砷剂对肺腺癌细胞的杀伤作用.方法 构建TP53INP1重组真核表达质粒,以慢病毒为载体将其转染到A549细胞,建立稳定高表达TP53INP1基因的A549-TP53INP1细胞株,以流式细胞术和MTT实验检测As2O3处理后A549-TP53INP1细胞的凋亡和存活率.结果 成功构建稳定A549-TP53INP1细胞株.流式细胞术结果显示,相同剂量As,O3作用下(5～ 40 μmol/L),A549-TP53INP1细胞凋亡率[(15.6±3.5)％]显著高于A549细胞[(10.0±2.5)％](P＜0.05).MTT实验显示,As2O3处理后A549-TP53INP1细胞的IC50值[(44.64±6.84)μmol/L]显著低于A549细胞[(54.25±6.13)μmol/L] (P ＜0.05).结论 TP53INP1高表达可增加砷剂对肺腺癌细胞的杀灭作用,提示TP53INP1可作为砷剂治疗肺癌的增敏靶点.
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miRNAs对白内障患者晶状体上皮细胞中氧化损伤的生物学效应及其机制
目的 探讨miR-204对年龄相关性白内障患者晶状体上皮细胞(LECs)中氧化损伤的生物学效应及其机制.方法选取30例皮质性年龄相关性白内障患者的晶状体前囊膜和30例正常供体眼球晶状体前囊,采用实时荧光定量PCR检测其中miR-204的相对表达量.对LECs系HLE-B3进行培养,在对数期细胞培养液中加入终浓度200 μmol/L的过氧化氢建立LECs氧化损伤模型,之后分为模型对照组、miR-204拟似物组、miR-204拮抗物组、拟似物对照组、拮抗物对照组,分别向细胞培养液中加入相应转染剂,未用过氧化氢处理的LECs为正常对照组.采用实时荧光定量PCR检测各组LECs中miR-204的表达量以验证转染率;流式细胞仪测定各组细胞凋亡率;实时荧光定量PCR和Western印迹法检测LECs中TP53INP1 mRNA和p53 mRNA和蛋白的表达量.结果 miR-204 mRNA在年龄相关性白内障患者晶状体组织中的表达量明显低于正常人(P<0.05).细胞转染后各组间miR-204 mRNA表达量差异均显著(P<0.05),其中miR-204拟似物组明显高于拟似物对照组,miR-204拮抗物组明显低于拮抗物对照组(P<0.01).模型对照组细胞凋亡率明显高于正常对照组,miR-204拟似物组明显低于拟似物对照组,miR-204拮抗物组明显高于拮抗物对照组(P<0.05),但拟似物对照组和拮抗物对照组之间差异无统计学意义(P>0.05).模型对照组TP53INP1和p53 mRNA及蛋白的表达量明显高于正常对照组;miR-204拟似物组明显低于拟似物对照组,miR-204拮抗物组明显高于拮抗物对照组(P<0.01, P<0.05).结论 miR-204可通过下调TP53INP1基因在LECs中的表达来抑制LECs凋亡,发挥抗年龄相关性白内障患者氧化损伤的作用,该作用通过影响TP53INP1-p53通路实现.
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MicroRNA-10b调控乳腺癌细胞生长增殖与凋亡的研究
研究MicroRNA-10b(miR-10b)对乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231的生长增殖和凋亡的调控作用.采用能模拟内源miR-10b的miR-10b模拟物以及能特异靶向敲除内源miR-10b的miR-10b抑制剂分别转染乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231.RT-PCR测定转染后细胞中miR-10b的表达水平,MTT检测miR-10b对细胞增殖活力的影响,流式细胞仪检测miR-10b对细胞周期和凋亡的影响.生物信息学软件预测miR-10b潜在的靶基因,3'UTR荧光素酶报告法验证其靶向性,Western blot检测caspase-3、P21的蛋白表达水平.研究证实,miR-10b模拟物上调乳腺癌中miR-10b的表达水平,与对照组相比,细胞增殖能力提高,细胞周期加速,细胞凋亡率降低;反之miR-10b抑制剂能显著下调miR-10b的表达,与对照组相比,细胞增殖能力降低,细胞周期阻滞,细胞凋亡率上调.初步探讨miR-10b的作用机制可能是通过靶向作用于TP53INP1,抑制细胞周期与凋亡关键蛋白caspase-3、P21的表达水平,从而促进乳腺癌的发生发展.
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miR-204对年龄相关性白内障LECs的抗氧化损伤作用及其机制
背景 miRNAs是一类非编码的小分子RNA,对LECs的凋亡发挥调控作用,但miRNAs对年龄相关性白内障患者LECs中氧化损伤的生物学效应及其机制仍需进一步研究. 目的 探讨miR-204在体内及体外对年龄相关性白内障氧化损伤的作用及其机制.方法 收集20例年龄相关性白内障患者的晶状体前囊膜和20个正常供体眼晶状体前囊膜,采用实时荧光定量PCR法检测2个组晶状体前囊膜中miR-204的表达量.对人晶状体上皮细胞系HLE-B3进行培养,在细胞培养液中添加200 μmol/L H2O2建立LECs氧化损伤模型,然后将细胞分为模型对照组、miR-204拟似物组、拟似物对照组、miR-204拮抗物组、拮抗物对照组,分别在细胞培养液中添加相应的转染剂,未用H202处理的LECs作为正常对照组.转染后24 h采用实时定量PCR法测定各组LECs中miR-204 mRNA的表达以验证转染率;采用流式细胞仪测定体外各组细胞的凋亡率;采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测LECs中TP53INP1及p53 mRNA和蛋白的相对表达量. 结果 年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜中miR-204 mRNA相对表达量明显低于正常人,差异有统计学意义(t=14.21,P＜0.05).正常对照组、模型对照组、miR-204拟似物组、拟似物对照组、miR-204拮抗物组、拮抗物对照组细胞凋亡率分别为1.31±0.12、4.90±0.28、2.60±0.15、4.39±0.20、5.74±0.13和4.34±0.63,模型对照组细胞凋亡率明显高于正常对照组,差异有统计学意义(t=-20.69,P＜0.01);miR-204拟似物组细胞凋亡率明显低于拟似物对照组,而miR-204拮抗物组细胞凋亡率明显高于拮抗物对照组,差异均有统计学意义(t=-12.20,P＜0.01;t=3.79,P＜0.05).实时荧光定量PCR和Western blot法检测结果显示,模型对照组细胞中TP53INP1、p53 mRNA及蛋白的相对表达量明显高于正常对照组,差异均有统计学意义(mRNA相对表达量:t=6.44、11.71,均P＜0.01;蛋白相对表达量:t=10.72、t=19.40,均P＜0.01);miR-204拟似物组细胞中TP53INP1、p53 mRNA和蛋白的相对表达量低于拟似物对照组,差异均有统计学意义(mRNA相对表达量:t=-19.28、-10.58,均P＜0.01;蛋白相对表达量:t=-6.50、-6.36,均P＜0.05);miR-204拮抗物组TP53INP1、p53 mRNA的相对表达量高于拮抗物对照组,差异均有统计学意义(mRNA相对表达量:t=4.07、3.74,均P＜0.05;蛋白相对表达量:t=7.18、10.58,均P＜0.05). 结论 MiR-204通过下调靶基因TP53INP1在LECs中的表达抑制LECs的凋亡,从而对年龄相关性白内障LECs发挥抗氧化损伤作用,该作用可能是通过影响TP53INP1-p53通路实现的.
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姜黄素通过下调microRNA-211表达促进结肠癌细胞的凋亡及其机制
目的：检测姜黄素对结肠癌细胞中微小RNA 211（microRNA 211，miR-211）表达的影响并探讨miR-211调控结肠癌细胞增殖和凋亡的可能机制。方法使用MTT法和流式细胞术检测不同浓度姜黄素在不同时间点对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响；使用实时荧光定量PCR（qRT- PCR）检测不同浓度姜黄素对结肠癌细胞中miR-211表达的影响；使用生物信息学预测miR-211下游靶基因TP53INP1并使用荧光素酶报告基因法验证其结合；用miR-211模拟物（miR-211 mimics）检测其对姜黄素处理的结肠癌细胞增殖的影响，同时使用Western blot法检测其对TP53INP1蛋白表达的影响；用TP53INP1小干扰RNA检测其对姜黄素处理的结肠癌细胞增殖和凋亡的影响。结果相较于未处理组，姜黄素在10～50μmol/L浓度可抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡（<0.05）。姜黄素可抑制肿瘤细胞中miR-211的表达，并具有时间和剂量依赖性（<0.05）；此外，miR-211下游靶基因TP53INP1蛋白表达量上调（<0.05）。用miR-211转染结肠癌细胞可逆转姜黄素对其增殖的抑制作用，并且TP53INP1表达下调（<0.05）；用TP53INP1小干扰RNA可逆转姜黄素对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响（<0.05）。结论姜黄素可通过下调miR-211抑制结肠癌细胞增殖并促进其凋亡，并且TP53INP1是miR-211下游调控蛋白之一。
