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幽门螺杆菌外膜蛋白25基因的克隆及序列分析
目的克隆幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)外膜蛋白25(OMP25)基因,并对其进行序列分析.方法利用PCR技术扩增OMP25基因,并将其定向插入pET-22b(+)载体中,以DNA自动序列分析仪进行核苷酸分析.结果DNA序列分析表明,所克隆的OMP25基因序列与GeneBank公布的一致.结论该研究获得了序列正确的幽门螺杆菌OMP25基因,为其重组表达及其相关研究奠定了良好基础.
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布鲁杆菌侵染巨噬细胞过程中与外膜蛋白25作用的受体筛选
目的 筛选布鲁杆菌侵染巨噬细胞过程中与布鲁杆菌外膜蛋白(OMP)25作用的受体.方法 利用已经构建的pET32a-omp25表达载体,在异丙基硫代半乳糖苷OPTG)诱导下表达重组OMP25.蛋白,Ni-NTA柱纯化OMP25蛋白;采用噬菌体展示技术从M13噬菌体环形多肽展示库中进行环形7肽(c7c)的筛选;生物信息学软件分析筛选出潜在多肽,用酶联免疫吸附试验(ELISA)验证OMP25与多肽分子的结合活性;合成结合力高的7肽分子,用菌落形成单位计数和ELISA法检测其在布鲁杆菌感染小鼠巨噬细胞过程中的功能.结果 噬菌体展示技术共筛选出42个7肽分子;生物信息学软件分析筛选出4个潜在多肽,ELISA证实4个7肽分子(ST-7、MT-7、TT-7和SN-7)能够与布鲁杆菌OMP25蛋白具有高亲和力;菌落形成单位计数结果显示:多肽分子ST-7、MT-7、TF-7和SN-7在布鲁杆菌黏附或抑制胞内寄生中均有一定作用.ST-7、MT-7、TF-7和SN-7对牛种布鲁杆菌2308菌株的抑制率范围分别为14.4％～51.8％、49.6％～69.5％、43.2％～74.4％、57.5％ ～82.2％.ELISA结果显示,与对照组比较,ST-7和MT-7多肽实验组肿瘤坏死因子(TNF-α)的量在各个时间点的差异无统计学意义(P均＞ 0.05);而TF-7和SN-7多肽实验组TNF-α的量在8h前差异无统计学意义(P均＞0.05),但在12、24h时促进TNF-α的分泌,差异具有统计学意义(P均＜0.05).结论 筛选获得4个有效的OMP25作用受体,其中TF-7、SN-7对布鲁杆菌2308侵染小鼠巨噬细胞既抑制入侵又抑制胞内生存,ST-7、MT-7对其只起抑制入侵的作用.
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幽门螺杆菌OMP25基因的克隆、测序及生物信息学分析
目的克隆幽门螺杆菌(helicobacter pylori,Hp)外膜蛋白25(OMP25)基因,并对其进行测序及生物信息学分析.方法利用PCR技术扩增OMP25基因,并将其定向插入pET-22b(+)载体中,以DNA自动分析仪进行序列测定,并以生物信息学软件分析其生物学特性.结果成功克隆了幽门螺杆菌OMP25基因,经测序表明其序列与GeneBank公布的一致.DNAstar软件预测其蛋白质的相对分子量(Mr)约为72.4 kD,并显示出良好的抗原性.结论本研究获得了序列正确的OMP25基因,为其重组表达及其相关研究奠定了良好基础.
