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flaB-PCR在钩端螺旋体病检测中应用
目的探讨flaB-PCR对组织标本中钩端螺旋体检测的可行性,为钩端螺旋体流行病学调查提供一种快速、有效的技术手段.方法根据黄疸出血型钩体赖株高度保守序列flaB设计一对引物,用PCR方法对实验动物标本及疫区动物标本中的钩端螺旋体DNA进行flaB基因片断扩增,扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测.结果该引物可特异性扩增钩端螺旋体DNA,而对本实验所用其它细菌均不扩增.肾组织中含10条钩端螺旋体经flaB-PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳可以目测到扩增产物.26份人工感染钩端螺旋体的动物脏器标本,flaB-PCR扩增阳性10份,阳性率38.46%;细菌分离阳性2份,阳性率7.69%,2种方法比较差异有统计学意义(χ2=6.93,P＜0.01).疫区70份蛙肾标本,分离细菌8株,阳性检出率11.43%;flaB-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳阳性14份,阳性检出率20%.细菌分离阳性的标本flaB-PCR均为阳性.结论 flaB-PCR灵敏、特异、快速,是钩端螺旋体检测的有效方法,可用于钩体病疫情监测和流行病学调查.
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幽门螺杆菌鞭毛蛋白B亚单位原核表达系统的构建及其产物的免疫性
目的构建幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)鞭毛蛋白B亚单位(flaB)原核表达系统,并鉴定其表达产物的免疫性.方法采用PCR从幽门螺杆菌基因组DNA中扩增全长flaB基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET32a-flaB表达载体,以E.coliBL21DE3为表达宿主菌,用SDS-PAGE检测重组蛋白(rFlaB)的表达水平.采用Hp全菌抗体的Westem blot和兔抗rFlaB血清的免疫扩散试验鉴定其免疫反应性和抗原性.结果所克隆的flaB基因与文献报道的核苷酸序列同源性为96.31%～97.73%,氨基酸序列同源性高达99.41%～100%.构建的原核表达系统pET32a-flaB-E.coliBL21DE3的rFlaB产量为细菌总蛋白的40%左右.Hp全菌抗体能识别rFlaB.rFlaB免疫家兔能获得高效价血清抗体.结论已成功地构建了Hp flaB高效原核表达系统,所表达的rFlaB有良好的免疫反应性和抗原性,可作为Hp疫苗的候选抗原.
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幽门螺杆菌临床菌株flaB基因的克隆和表达及鉴定
目的:克隆幽门螺杆菌(Hp)鞭毛素B基因(flaB),构建其原核表达系统,鉴定融合蛋白免疫性.方法:采用高保真PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株Y06中扩增flaB基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET32a的flaB表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,采用Hp全菌抗体的Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性.ELISA检测125例胃、十二指肠粘膜活检标本尿素酶阳性患者血清中FlaB抗体和41株Hp临床菌株FlaB表达.结果:所克隆的flaB基因与报道的相应核苷酸序列同源性为96.31%～97.73%,氨基酸序列同源性高达99.41%～100.00%.pET32a-flaB-BL21DE3系统的FlaB融合蛋白表达量为细菌总蛋白的40%左右.FlaB融合蛋白能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔能获得高效价抗体.结论:本研究成功地构建了Hp flaB高效原核表达系统,所表达的FlaB融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性;Hp临床菌株FlaB表达率高,且能刺激机体产生抗体.FlaB可作为Hp疫苗及诊断试剂盒的抗原.
