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体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞
目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.
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人胚胎干细胞向类间充质干细胞的诱导分化及鉴定
目的 建立诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的方法,并鉴定细胞的生物学特性.方法 人胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养形成类胚体,10 d后在含血清条件下使类胚体贴壁生长,5～6 d后机械法剔除类胚体中心区高密度重叠细胞,保留周边铺展细胞并传代扩增.观察诱导分化与传代扩增后细胞的形态学变化;免疫荧光染色和流式细胞术进行细胞表型分析.取第5代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,3～4周后运用特殊染色及RT-PCT技术检测细胞成脂、成骨及成软骨分化能力.结果 诱导分化后细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的形态,扩增能力较强,多次扩增传代后细胞形态和增殖能力无明显改变.免疫荧光染色发现细胞表达中胚层标志波型蛋白(vimentin).流式细胞术分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166等间充质干细胞表面标志.特殊染色及RT-PCT检测结果显示,成脂诱导后多数细胞油红染色阳性,脂蛋白酶和leptin表达增加;成骨诱导后细胞茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强.结论 成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化.分化获得的细胞增殖能力强,表达间充质干细胞的特异性标志,并具有多向分化潜能.
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SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞
目的 为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞.方法 以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1.传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能.结果 hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长.经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织.结论 SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能.
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Tα1启动子驱动的荧光报告系统在人胚胎干细胞神经分化示踪中的应用
目的 观察携带Tα1(α-tubulin)基因启动子驱动的荧光报告系统在人胚胎干细胞(hESCs)神经分化示踪中的应用.方法 胎鼠成纤维细胞(MEF)培养hESCs,免疫荧光染色鉴定其生物学标记.将携带pLV/Final-puro-Tα1(α-tubulin)-hrGFP载体的慢病毒感染人胚胎干细胞(hESCs),嘌呤霉素(puromycin)筛选14 d后获得纯化hESCs,并诱导其向神经元样细胞分化,同时显微镜观察细胞绿色荧光变化.第23天对表达绿色荧光的细胞行免疫荧光染色鉴定.结果 hESCs细胞的OCT-4、SSEA-4及TRA-1-60表达呈强阳性.慢病毒感染并筛选14 d后得到具有puromycin抗性的纯化hESCs.该细胞经神经分化后,显微镜下观察到绿色荧光表达,且α-tubulin、βⅢ-tubulin、nestin表达均呈阳性.结论 成功获得了表达Tα1(α-tubulin)-hrGFP载体的hESCs,该细胞可以示踪Tα1的表达.
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稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系的建立
目的:建立可以稳定表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)系.方法:优化核转染方法后,将RFP表达载体pEF1α-DsRed-Express2导入hESCs中.利用碱性磷酸酶染色、RT-PCR、免疫荧光染色和类胚体形等方法,比较核转染前后hESCs的干细胞特性.结果:核转染后hESCs的碱性磷酸酶染色结果为阳性.核转染前后hESCs的Oct4、Sox2、Klf4、Nanog基因的表达未出现明显差异.RFP-hESCs具有三胚层分化潜能,并且可稳定传30代以上.结论:成功建立稳定表达红色荧光蛋白的hESCs,干细胞特性不受RFP的影响,可用于后续的实验研究.
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贴壁法与悬浮法诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞的对比研究
目的 对比研究直接贴壁法与悬浮法分别诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞所需的时间、分化成功率,以及分化后细胞的活性、抗缺氧凋亡刺激的能力.方法 人胚胎干细胞分别通过悬浮法和直接贴壁法诱导分化为心肌细胞.免疫荧光染色检测心肌细胞特异标志物cTnT;显微镜下计数比较两组细胞诱导分化出现跳动心肌细胞的时间、百分比和跳动频率;跳动心肌细胞经过24h缺氧刺激后,用凋亡试剂盒检测心肌细胞凋亡比例.结果 直接贴壁法诱导分化为心肌细胞的成功率更高(66.7％比20.8％,P＜0.05);大量的自发跳动心肌细胞出现时间直接贴壁法早与悬浮法,差异有统计学意义[(13.0±1.1)天比(13.9±0.9)天,P＜0.05];分化的心肌细胞cTnT染色均阳性,均检测到自发性动作电位;分化后的心肌细胞平均跳动频率范围两种方法相仿[(63.0±7.0)次/分比(63.8±5.6)次/分,P＞0.05];跳动心肌细胞缺氧24h后检测到的凋亡比例比较差异无统计学意义[(8.0±0.5)％比(8.1±0.4)％,P＞0.05].结论 两种方法均能成功诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞,直接贴壁法分化成功率更高,所需分化时间较短;两种方法分化出的心肌细胞在细胞活性方面以及抗凋亡能力方面无明显差异.
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APJ在hESCs定向心肌分化过程中的表达特征
目的：在人胚胎干细胞( hESCs)定向心肌分化过程中,以中胚层阶段(d2)、心肌细胞起始分化阶段(d3)、心肌细胞后分化阶段( d7)为时间节点,探索 APJ 的表达特征。方法 hESCs经单层培养后,应用化学成分明确的诱导分化培养基定向诱导hESCs向心肌细胞分化,再于d2、d3、d7阶段分别进行细胞免疫荧光检测,共聚焦显微镜观察Brachyu-ry T、mesp1、Nkx2．5与APJ的蛋白表达情况,实时荧光定量PCR法检测4种标志物mRNA的表达水平。结果诱导d7开始出现跳动的细胞,跳动细胞数量d7~d16逐渐增加,d16达高峰。细胞免疫荧光结果显示跳动的细胞心肌特异性标志物a-Actinin、cTNNT2表达阳性,并可见到明显的肌节及润盘结构；APJ 在 d2、d3、d7阶段分别与阶段特异性标志物Brachyury T、mesp1、Nkx2．5共表达。3个阶段中APJ mRNA呈持续性表达,在中胚层起始时表达高,中胚层后表达逐渐降低。结论 APJ与代表hESCs心肌分化过程中的阶段特异性标志物Brachyury T、mesp1、Nkx2.5共表达,证实APJ在人心肌细胞发育的整个过程中持续性表达。
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人胚胎干细胞培养体系的研究进展
人胚胎干细胞(hESC)具有显著的增殖能力和分化潜能,已经成为研究再生医学、药物学、药理毒理学、人胚胎发育学和功能基因组学的种子细胞库.hESC在长期维持培养中保持增殖潜能和未分化状态需要饲养层细胞或基质蛋白、血清或基因敲除血清(KSR)以及碱性成纤维生长因子、骨形态蛋白、转化生长因子、激活素A等生长因子.本文就hESC培养体系的传统小鼠胚胎成纤维细胞饲养层、人源性饲养层、Matergel胶、KSR取代血清、在基质中加入明确的不同的细胞因子等培养方案和hESC的组织工程学应用的研究现状及进展作一综述.
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人胚胎干细胞的研究进展
人类胚胎干细胞系的建立是人类发育生物学研究的重大突破,揭示了人体发生发展奥秘的进程,可能为现代临床医疗模式带来革命性的变化.现对人类胚胎干细胞的来源,建系、生物学特性、应用前景及所涉及的伦理学问题作一综述.
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人胚胎干细胞饲养层培养体系的建立
目的建立人胚胎干细胞饲养层培养体系.方法以胎鼠和人胎儿为材料,以DMEM加15% FBS加0.1mM2ME为基础培养液,分别制备胎鼠和胎儿成纤维细胞饲养层.结果分别获得了传16代的胎鼠成纤维细胞和传7代的人胎儿成纤维细胞,建立了人胚胎干细胞饲养层的培养体系.结论胎鼠成纤维细胞和人胎儿成纤维细胞相比较,后者生长速度慢,且较易老化;胎鼠成纤维细胞饲养层更有利于人胚胎干细胞的生长;8～14d龄胎鼠适宜制备人胚胎干细胞饲养层;在室温条件下,以0.2%胰酶加0.04%EDTA为消化液处理原代胎鼠组织块时间以15～20min为宜.
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Apelin13对人胚胎干细胞定向心肌细胞分化效率的影响
目的 探讨Apelin13对人胚胎干细胞(hESCs)定向心肌细胞分化效率的影响.方法 将hESCs单层培养后经EDTA消化传代,应用明确的诱导分化培养基对观察组(加Apelin13)和对照组(不加Apelin13)定向诱导hESCs向心肌细胞分化.于诱导第2天(中胚层阶段)、第4天(心肌分化初始阶段)、第7天(心肌分化末阶段)作为时间节点,采用实时荧光定量PCR检测两组Brachury T、Mesp1、NKx2.5、APJ mRNA表达水平,采用Western blotting检测两组Brachury T、Mesp1、NKx2.5、APJ、Nanog、Sox2蛋白表达;同时于诱导第7天采用细胞免疫荧光技术检测两组心肌细胞标志物肌钙蛋白T2(TNNT2)、α-辅肌蛋白(α-actinin)表达.结果 诱导第7天观察组hESCs定向心肌分化程度高于对照组,免疫荧光染色倒置显微镜下可清楚看到成熟心肌细胞的肌结及心肌细胞TNNT2、α-actinin表达.在3个诱导时间节点,观察组Brachury T、Mesp1、NKx2.5、APJ mRNA及其蛋白表达均高于对照组(P均<0.05),观察组hESCs标志蛋白Nanog、Sox2低于对照组(P均<0.05).结论 Apelin13可提高hESCs向心肌细胞的分化效率.
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人胚胎干细胞神经分化中VEGF作用的分子机制研究
目的 观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对人胚胎干细胞分化为神经元的促进作用是否与p38MAPK信号通路相关.方法 人胚胎干细胞经拟胚体向神经元分化,分为3组:A组:常规诱导组;B组:常规诱导+VEGF(10 ng/mL)作用组;C组:常规诱导+p38 MAPK抑制剂预处理+VEGF(10 ng/mL)作用组.免疫荧光法检测计算各组不同阶段细胞阳性率,半定量RT-PCR观察各组神经干细胞p38 α mRNA表达,MTT法检测3组神经干细胞增殖速率.结果 免疫荧光法检测,B、C 2组产生神经干细胞的阳性率明显高于A组,差异有统计学意义(P＜0.01),B、C 2组比较差异无统计学意义(P＞0.05);B组进一步分化为神经元的阳性率明显高于A、C组,差异有统计学意义(P＜0.01),A、C 2组比较差异无统计学意义(P＞0.05);半定量RT-PCR观察B组神经干细胞p38 α mRNA表达明显高于A、C 2组;MTT法检测与半定量RT-PCR结果相似.结论 人胚胎干细胞体外分化过程中,血管内皮生长因子促进神经干细胞分化的作用与p38 MAPK通路无关,而VEGF通过激活p38 MAPK信号通路,促进神经干细胞进一部分化为神经元.
关键词： 人胚胎干细胞 神经分化 血管内皮生长因子 p38MAPK信号通路 -
人胚胎干细胞定向分化为晶状体小体过程中晶状体发育相关转录因子的动态变化
目的 探讨人胚胎干细胞(hESC)定向分化为晶状体小体(LB)过程中晶状体发育相关转录因子的表达特点和规律. 方法 通过“三阶段法”体外诱导hESC定向分化为LB.取hESC(D0)和诱导分化不同时间点的细胞,应用高通量测序技术,通过生物信息学方法分析晶状体发育相关的转录因子及其亚型的表达变化特点和规律.采用Western blot法和免疫荧光染色技术对相关基因在蛋白水平的表达进行检测.结果 光学显微镜下,未分化的hESC呈圆形;分化后0～6 d(D0 ～ D6)的细胞更圆且排列更紧密;D7～D18细胞由圆形逐渐延长变为梭形;D19 ～ D32,形成有三维立体结构的透明结构,即LB.荧光定量PCR结果显示,干细胞标记基因的表达在分化过程显著降低,而晶状体特异性基因的表达明显升高.免疫荧光染色结果显示,LB表达晶状体特异性蛋白α-crystallin和β-crystallin.高通量测序聚类分析结果显示,D0与D32之间的转录因子基因表达谱差异为显著,而D6和D18之间的差异小.前基板基因DLX3、DLX5、DLX6、HES1、HES4、OTX2和EYA1在分化第一阶段表达显著升高,随后下降;晶状体特异性基因中SOX2蛋白表达逐渐降低,而后升高,而PAX6蛋白的表达随分化时间延长逐渐增加;晶状体分化基因MAB21L1、CMAF、PROX1及PITX3等在分化早期变化不显著,在分化第三阶段表达明显增加. 结论 体外定向分化的3个阶段依次对应体内晶状体发育的前基板外胚层(PPE)阶段、前晶状体外胚层(PLE)和晶状体外胚层(LE)阶段、晶状体泡(LV)和晶状体细胞分化阶段,提示hESC体外定向分化过程很好地模拟了体内晶状体的胚胎发育过程,为研究晶状体发育和先天性晶状体疾病的分子机制提供了理想的模型.
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人胚胎干细胞培养的相关因素分析
人胚胎干细胞(HESC)是一种存在于着床前胚胎,能在体外进行培养传代,保持未分化二倍体状态,具有分化发育成3个胚层组织细胞潜能的全能性细胞[1]。目前已有多个实验室对HESC进行广泛的研究,由于HESC的原代培养尤其重要,本实验旨在探讨其原代培养相关影响因素。一、材料和方法1.材料:DMEM培养基、HESC专用胎牛血清、L-谷氨酰胺及胰蛋白酶、丝裂霉素、白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等均购自武汉大风公司。
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人胚胎干细胞神经分化过程中VEGF作用机制的研究
目的 观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对人胚胎干细胞分化为神经元的促进作用是否与Notch信号通路有关.方法 人胚胎干细胞经拟胚体向神经元分化,并分为3组:A组为常规诱导组;B组为常规诱导+VEGF(10ng/ml)作用组;C组为常规诱导+γ-分泌酶抑制剂预处理+VEGF(10ng/ml)作用组.用免疫荧光法检测及计算各组不同阶段细胞阳性率,半定量RT-PCR观察各组神经干细胞Hes1mRNA表达,MTT法检测3组神经干细胞增殖速率.结果 免疫荧光法检测显示,B组产生神经干细胞的阳性率明显高于A、C两组,差异有统计学意义(P<0.01),A、C两组之间无显著性差异(P>0.05);B、C两组进一步分化为神经元的阳性率均明显高于A组,差异有统计学意义(P<0.01),B、C两组之间无显著性差异(P>0.05);半定量RT-PCR观察显示B组神经干细胞Hes1mRNA表达明显高于A、C两组;MTT法检测与半定量RT-PCR结果相似.结论 人胚胎干细胞体外分化过程中血管内皮生长因子通过激活Notch信号通路,促进神经干细胞增殖,而VEGF在神经干细胞向神经元分化中的作用与Notch通路无关.
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VEGF在人胚胎干细胞向神经元分化中作用的研究
目的 观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在人胚胎干细胞分化为神经元过程中是否发挥作用及相关机制.方法 人胚胎干细胞经拟胚体向神经元分化,分为3组:A组为常规诱导组,B组为常规诱导+VEGF(10 ng/mL)作用组,C组为常规诱导+VEGF(10 ng/mL)+VEGFR2/Fc嵌合体(10 ng/mL)作用组;用RT-PCR、免疫荧光法检测各阶段细胞标志物,计算并用流式细胞仪检测各组不同阶段细胞阳性率.结果 用RT-PCR分别检测到OCT4、Nestin、MAP2表达;免疫荧光法检测显示B组产生神经干细胞、分化为神经元的阳性率明显高于A、C两组,差异有统计学意义(P<0.01),A、C两组之间无显著性差异(P>0.05);流式细胞仪检测与免疫荧光法相似.结论 人胚胎干细胞体外分化过程中血管内皮生长因子通过血管内皮生长因子受体2来促进神经干细胞增殖及向神经元分化.
关键词： 人胚胎干细胞 神经分化 血管内皮生长因子 血管内皮生长因子受体2 -
人胚胎干细胞培养及其cDNA文库的构建
目的 构建人胚胎干细胞cDNA文库,为筛查疾病抗原基因奠定基础.方法 培养和收集人胚胎干细胞克隆,提取胚胎干细胞总RNA,分离纯化mRNA,利用mRNA作模板反转录合成双链cDNA,双链DNA经pfu-DNA聚合酶将链末端补平,与EcoRⅠ接头连接,XhoⅠ酶切消化产生粘端.用Sepharose CL2B柱分离纯化及除去小分子cDNA片段,与Uni-ZAP XR噬菌体连接,体外转化XL1-blue MRF菌,建成cDNA文库并计算重组效率.对cDNA文库进行扩增,测定扩增文库的滴度.阳性重组子用EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切鉴定插入片段的大小.结果 构建成含1.2×106重组子的人胚胎干细胞cDNA文库,重组子插入外源DNA片段长度不小于1000 kb.结论 已成功构建人胚胎干细胞cDNA文库,适合用于筛选目的基因克隆.
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TMSN-AA纳米复合物促进人胚胎干细胞向心肌细胞分化的潜在机制研究
目的 研究优化后的TMSN-AA纳米复合物促进人胚胎干细胞(hESCs)心肌分化的可能性,并探讨其诱导心肌分化的潜在机制.方法 采用优化抗坏血酸(AA)负载的荧光TRITC介孔二氧化硅纳米粒子(TMSN-AA)作为诱导剂,诱导hESCs细胞心肌分化.通过荧光定位检测该诱导剂进入细胞情况,流式细胞仪检测其进入细胞后对细胞存活与凋亡的影响,Western blot检测TMSN-AA诱导后,心肌标记基因cTnI、FLK-1以及干性基因OCT4和SOX2的表达以及相关信号通路ERK1/2的激活情况.结果 荧光定位发现TMSN-AA可以靶向进入hESCs细胞,流式细胞仪分析结果显示,二氧化硅和荧光染料四甲基罗丹明修饰介孔二氧化硅不会影响hESCs的存活和凋亡;且TMSN-AA诱导后,干性基因OCT4和SOX2均下调,且上调心肌标记基因cTnI和FLK-1的表达.Western blot检测结果显示,TMSN-AA的处理可以激活ERK1/2信号通路,同时证实,该过程Akt信号通路并未参与其中.结论 优化后的TMSN-AA纳米载体可以成功进入hESCs细胞,并靶向诱导其心肌分化,而该诱导过程,至少在一定程度上是通过激活ERK1/2,而不是Akt信号通路实现的.
关键词： 人胚胎干细胞 抗坏血酸 介孔二氧化硅纳米粒子 -
利用荧光素酶报告基因在体观察移植的人胚胎干细胞的动向
目的 利用慢病毒载体携带荧光素酶报告基因并转导人胚胎干细胞,以实现在体观察移植细胞的增殖情况.方法 酶切pGL3 base质粒获得荧光素酶基因序列,酶切LTBR-GIP获得载体骨架,经过酶切产物热失活、平末端处理、CIP处理、胶纯化和连接,所构建慢病毒载体命名为ULIP,包括UBC启动子和IRES连接,能同时表达荧光素酶基因和Puromycin抗性基因.以ULIP转导人胚胎干细胞H9,并以Puromycin筛选稳定转导的细胞.随后移植于BALB/c小鼠和RAG-/-γC-/-小鼠,在Xenogen IVIS (r)50成像系统进行荧光信号检测.结果 稳定转导ULIP或LTBR-GIP的H9移植到BALB/c小鼠,ULIP组3d后荧光信号明显减弱,5d后基本上不能检出.而移植到RAG-/-yC-/-小鼠后,ULIP组的荧光信号在第3天稍有下降,随后荧光信号逐渐增强.LTBR-GIP-H9在移植BALB/c小鼠和RAG-/-yC-/-小鼠后均未能检测到荧光信号.结论 荧光素酶报告基因可以用于观察移植细胞在体内的动向,实现实时观察移植细胞的存活情况.
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体外直接诱导人胚胎干细胞向神经细胞分化的研究
目的 探讨体外直接诱导HSF6人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)分化为神经细胞的方法.方法 采用直接的方法,在1％血清培养条件下,顺序添加bFGF、RA和Forskolin,诱导HSF6人ESCs分化为神经细胞.结果 细胞发生神经样形态学改变,免疫荧光细胞化学分析结果显示,分化细胞表达神经干细胞特异性标志分子——巢蛋白( nestin),以及神经元标志分子——β微管蛋白Ⅲ(neuron-specific classⅢ beta-tubulin,TuJ1).实验组nestin阳性细胞数占(95.2±3.03)％,明显高于未添加诱导因子组的(31.6±4.93)％,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 本研究直接诱导hESCs分化为神经细胞,减少了常规经胚胎体(embryoid body,EB)的诱导方法而产生其它胚层细胞的机会,为进一步探索hESCs源性神经细胞的功能,以及为细胞替代治疗提供高纯度的hESCs源性神经细胞奠定了基础.
