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构建特发性脊柱侧弯椎间盘终板抑制消减cDNA文库的方法和意义
目的:构建青少年特发性脊柱侧弯椎间盘终板抑制消减cDNA文库,以研究特发性脊柱侧弯的基因表达变化间的内在联系及规律.方法:从来源于一位特发性脊柱侧弯患者顶椎椎间盘终板凸凹侧软骨组织分离poly(A)+RNA,经反转录后,利用抑制消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库.结果:挑取300个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示其中248个克隆有插入片段,片段大小范围为250～750pb.结论:应用消减杂交的方法,再经适当的改进,在去除相同遗传背景的条件下,可以建立较特异性脊柱侧弯椎间盘终板cDNA消减文库,该文库为进一步批量筛选特发性脊柱侧弯发生的相关基因群并克隆特发性脊柱侧弯相关表达基因,研究其特发性脊柱侧弯发生的分子机理与生物学特性间的关系奠定了基础.
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致农民肺嗜热吸水链霉菌cDNA文库的构建及体外表达
目的 构建致农民肺嗜热吸水链霉菌cDNA文库并进行EST测序,通过生物信息学软件分析EST序列同源性及生物学功能,筛选重组阳性基因克隆进行体外表达.方法 利用SMART方法构建致农民肺嗜热吸水链霉菌的cDNA文库,随机挑选重组阳性克隆进行EST测序.挑选有关目的基因连接入pET-28a载体并转化大肠埃希菌BL2 (DE3),IPTG诱导体外表达.结果 该文库的重组率为96.3％,是一个较高质量的文库.从文库中随即挑选的1 020个重组阳性的克隆,获得978个有义序列,平均长度为495 bp,含有347个单一基因,同源性比较发现部分序列与猪胸膜肺炎放线菌外膜蛋白(omla),转铁蛋白B(TbpB)具有较高的同源性,分别为51％和42％.将重组阳性的基因克隆至载体中,IPTG诱导得到表达产物的相对分子质量分别为63×10 3和30× 103.结论 所构建的致农民肺嗜热吸水链霉菌cDNA文库包含全部EST序列,可能包含嗜热吸水链霉菌相关疾病巨大部分毒力分子,这些数据的积累将有助于农民肺特异性毒力分子的进一步筛选,同时为研究农民肺的发病机制奠定基础,如果能准确筛选出相关毒力基因,将为农民肺血清学诊断以及特异性疫苗的研发奠定基础.
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冬虫夏草cDNA文库的构建和鉴定
目的 分别构建冬虫夏草子座和虫体部分的cDNA文库.方法 裂解法提取总RNA,磁珠法分离mRNA,反转录合成双链cDNA,末端补平,连接EcoR Ⅰ并磷酸化,胶回收目的片断,连接载体pBluescriptⅡ SK(+)XR并电转化感受态细胞DH10B,测定文库的克隆数、重组率,PCR测定插入片断大小.结果 所建文库库容量分别为:子座部分1.0×106克隆、虫体部分1.28 × 106克隆;重组率分别为:子座部分87.5%、虫体部分68.75%,片段的大小范围均在0.5～2 kb之间.结论 分别构建了野生冬虫夏草子座和虫体部分的cDNA文库.
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连作地黄cDNA消减文库的构建及分析
目的:通过构建连作地黄cDNA消减文库,探讨地黄连作障碍的分子机制.方法:利用抑制性消减杂交(SSH)技术构建连作地黄的正反消减文库,通过蓝白斑筛选、PCR的方法鉴定出阳性克隆,并对其进行测序和生物信息学分析.结果:连作地黄cDNA消减文库构建成功,正向和反向消减文库均筛选了300个阳性克隆.测序结果表明:正库、反库分别获得232条、214条特异的EST序列;经NCBI数据库分析,正库、反库中分别有200,195条EST序列的基因具有蛋白功能注释;COG基因功能预测结果表明,正库、反库中分别有60,61条EST序列具有相应的的基因功能分类,涉及21个代谢途径.结论:差异表达基因的功能注释表明,连作对地黄体内的基因表达具有深刻的影响.本研究筛选地黄响应连作的关键基因,为揭示地黄连作障碍的分子机制奠定了基础.
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甘草根cDNA文库构建与分析
目的:构建甘草cDNA文库,为甘草功能基因的研究以及筛选、克隆与甘草次生代谢产物合成途径相关基因奠定基础.方法:以LiCl沉淀法提取根组织总RNA,置换合成法合成双链cDNA,末端补平,连接EcoR I并磷酸化,以pBlueScriptⅡ为载体并电转化感受态细胞E.coli DH10β,测定文库的克隆数、重组率,PCR测定插入片断大小.同时,对文库进行随机测序并在GenBank中进行同源性检索和功能预测.结果:经鉴定文库的库容量为1.15×107,重组率为98.2%,插入片段在0.5～4.8 kb,平均片段长度大于1.0 kb;经随机测序,获得126条EST,BLAST分析表明,大多数EST与豆科植物以及拟南芥、水稻等植物基因序列具有较高的同源性,在86条已知功能基因中,主要为细胞代谢、抗逆性、生长抑制及休眠相关的基因,其余40条EST为未知功能基因.结论:构建的甘草根cDNA文库库容量大、重组率高且插入的cDNA片段较长,能够满足甘草功能基因的研究.
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铁皮石斛均一化全长cDNA文库的构建与序列分析
目的:为了获得药用植物铁皮石斛功能基因的信息和筛选功能基因.方法:以SMART(switching mechanism at 5'end of RNA transcript)方式合成伞长cDNA,结合DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术,构建铁皮石斛茎组织的均一化全长cDNA文库.结果:该文库重组[率为93.9％,文库滴度1.3×106cfu·mL-1,插入片段平均大小1.5kb左右.随机挑取163个阳性克隆进行单侧测序,通过生物信息学分析,获得150个单一序列,其中147个序列与相应的同源蛋白匹配,GO(gene ontology)分类表明这些序列参与各种生化途径.8个序列包含了完整编码框,可判断为全长基因.结论:成功构建了铁皮石斛茎组织均一化全长cDNA文库,为满足铁皮石斛代谢途径等功能基因筛选和基因信息研究奠定了基础.
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翼状胬肉cDNA文库的构建及序列分析
目的 研究翼状胬肉形成的机制及其形成的相关基因.方法 利用SMART技术构建翼状胬肉组织的cDNA文库,随机挑取800个克隆进行测序和分析.结果 该文库的库容量为1.2×106,重组率为94％,平均插入片段大小为1 kb左右.经Phrap软件聚类拼接后得到663条单基因簇,包括549个单拷贝和114个重叠群.使用BLAST软件进行同源性分析,发现85条序列(12.82％)没有功能注解;578条序列(87.18％)有功能注解.将所得的578条序列(ESTs)按照人组织基因表达谱分类标准进行分类,其中与转录和翻译相关基因的EST多,占到41％.同时还发现了一些可能参与翼状胬肉形成的相关基因.结论 在国内首次构建了翼状胬肉的cDNA文库,为研究翼状胬肉的发病机理提供了新思路.
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可卡因苯丙胺调节转录肽相互作用蛋白的筛选
目的 寻找可卡因苯丙胺调节转录肽(CART)受体或与其相互作用的蛋白.方法 建立大鼠脑cDNA文库,以CART为诱饵,应用细菌双杂交方法筛选与CART相互作用的蛋白.结果 成功构建大鼠脑pTRG-cDNA文库及诱饵质粒pBT-CART41-102.文库容量为3.37×106,重组率98.5%.筛选约5.01×106个共转化克隆,证实为阳性克隆93个,全部DNA测序.经生物信息学方法分析得到stathmin等6个可能与CART相互作用的蛋白,并得到可能与CART相互作用的未知新蛋白,它们与22个已知膜蛋白或受体有短的极相似片段.结论 CART可能与stathmin等6个已知蛋白相互作用,并可能与一些未知蛋白相互作用,这些未知蛋白与22个膜蛋白或受体有短的相似保守结构.
关键词： cDNA文库 Cart 细菌双杂交系统 蛋白质-蛋白质相互作用 -
金仓鼠神经管cDNA文库的建立
目的构建金仓鼠神经管cDNA文库,以筛选与神经管发育及神经管畸形发生相关的基因.方法用TRIZOL Reagent提取金仓鼠神经管总RNA;用LD-PCR法反转录合成双链cDNA;经蛋白酶K消化、Sfi Ⅰ酶切、CHROMA SPIN-400柱分离去除小于500bp的片段;将cDNA与载体λ Tripl EX2按一定比例连接;经体外包装,建立cDNA的噬菌体表达文库.结果cDNA文库容量为1.5×106pfu/ml,重组率为99%,平均插入片段大于1kb.结论我们初步构建的金仓鼠神经管cDNA文库为高效的cDNA文库.
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弓形虫RH株速殖子期表达型cDNA文库的构建及鉴定
为构建弓形虫速殖子期表达的基因的完整长度cDNA文库,用CF-11纤维素柱快速提纯速殖子,以盐酸异硫氰酸胍(AGPC)一步法抽提总RNA,oligo-dT纤维素分离mRNA后,用ClonTech公司的SmartTMPCRcDNA文库构建试剂盒,构建了弓形虫RH株的表达型文库.获得5×106个独立克隆,重组率为90%,插入片段的平均长度约为1kb.根据已知序列设计引物,从cDNA文库中扩增出编码棒状体蛋白l(ROPl)的基因(不含编码信号肽的序列),本文库可望用于弓形虫疫苗研究的候选基因的筛选.
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18日龄日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库的构建
为揭示血吸虫生长发育机理,深入研究血吸虫与宿主、血吸虫雌雄虫之间蛋白质的相互关系,本研究选取血吸虫进入终末宿主体内18天时的虫体(发育成熟初期),采用Clontech Matchmaker技术成功构建日本血吸虫的酵母双杂交cDNA文库.该文库具有基因多样性和足够大的库容量,库容量为2.5×106 pfu/mL,插入的双链cDNA片段的长度在0.25～2.0 kb之间,文库重组比率为97.9%,具有良好的代表性.该文库的构建为筛选相互作用蛋白并进一步阐明其生理意义提供了基础.
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白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株4龄幼虫cDNA文库的构建
目的:构建白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株4龄幼虫cDNA文库.方法:抽提、纯化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株4龄幼虫总RNA,进行反转录合成第1链cDNA;用C1ontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒进行长距离PCR,合成全长双链cDNA;PCR产物经蛋白酶K消化、提纯后,进行Sfi I酶切;用Chroma Spin-400柱将酶切产物进行分级分离,然后经1.1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收400bp以上的组分,并与λTriplEx2载体连接;连接产物经体外蛋白包装,产生未扩增文库;检测未扩增文库滴度和重组效率后,进行文库的扩增,并测定扩增文库的滴度;随机挑取9个噬菌体,用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量.结果:经检测,未扩增文库滴度达2.0×107pfu/mL,重组效率在10-4稀释度时每块平板约210～255个噬菌斑中均未发现任何蓝色噬斑,扩增文库滴度达1.75×109pfu/mL;用载体克隆位点两端的引物进行PCR鉴定,结果显示:所选9个噬菌体中均含有重组的cDNA,并且均在500bp以上,其中1kb以上的有2个、700bp的有5个、500bp的有2个.结论:已成功地获得一高质量的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株4龄幼虫cDNA文库.
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广州管圆线虫幼虫cDNA文库的构建及其表达模式与成虫表达模式的EST分析
从感染广州管圆线虫3周的大鼠脑部挑取幼虫,提取其总RNA,运用"SMART cDNA文库构建试剂盒"构建其cDNA文库.分别将成虫和幼虫cDNA文库中的噬菌体克隆转化成噬菌粒,用5'端测序引物进行测序.利用BLAST程序对获取的EST从核苷酸和氨基酸水平进行同源性搜索.结果显示:所建文库的初始滴度为2.19 × 106pfu/mL,经1次扩增后的滴度为1.0×1010pfu/mL,插入子的平均长度为1.2kb,重组率为97.3%.从成虫的cDNA文库中得到64个EST,其中有意义的EST有54个,占82.8%;无意义的EST有10个,占17.2%.64个成虫EST序列中,rRNA基因49个,占总EST数的76.6%.从幼虫的cDNA文库中共得到106个EST,其中有意义的EST有91个,占85.8%;无意义的EST有15个,占14.2%.106个幼虫EST序列中rRNA基因78个,占总EST数的73.6%.本研究首次成功构建了广州管圆线虫幼虫的cDNA文库,EST分析显示广州管圆线虫幼虫和成虫基因表达谱中rRNA基因均占大多数.
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柔嫩艾美耳球虫卵囊cDNA文库的初建
利用Trizol一步法从柔嫩艾美耳球虫孢子化10h卵囊提取总RNA.利用poly(A)Quik mRNA Isolationkit分离纯化了mRNA.采用cDNA Synthesis Kit合成cDNA,以XR-λZAP为载体,构建了cDNA表达文库,经蓝白斑筛选,其重组率为98%,滴度为0.9×106pfu/mL,扩增后滴度为1×109pfu/mL.随机取10个克隆,提取λDNA后,经PCR鉴定,插入片段长度大于0.4Kb.该cDNA表达文库的构建为下一步功能基因的筛选等奠定了良好基础.
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猪囊尾蚴cDNA文库的构建
从猪囊尾蚴内提取mRNA经反转录合成cDNA, 应用定向克隆的方法,将合成的cDNA片段重组到噬菌体载体Uni-ZAP XR的EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切位点之间.5 μg poly(A)+ RNA所构建的表达文库容量为0.98×106重组子.经含有IPTG和X-gal的颜色选择平皿测定,提示重组率达86 %.随机取6个噬菌斑做PCR,检查插入片断的长度在100～2 020 bp 之间.
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日本血吸虫雌虫抗原免疫血清筛选成虫cDNA文库
目的筛选日本血吸虫(Schistosoma japonicum, Sj)新的疫苗候选基因或雌虫性别特异性基因. 方法用Sj雌虫抗原免疫家兔制备血清,对Sj成虫cDNA文库进行免疫筛选,将阳性克隆的插入片段进行PCR扩增,采用Sanger双脱氧核苷酸末端终止法对阳性克隆插入子进行测序,与GeneBank中的已知序列进行比对分析. 结果共获得26个阳性克隆,其PCR产物大小约0.5～3 kb.在进行测序的8个阳性克隆中发现了GeneBank未报道的Sj肌球蛋白的部分基因序列(GeneBank登录号为AY322148)和1个新基因(命名为Sj-F1,GeneBank登录号为AY261995).Sj-F1编码的蛋白理论分子质量为13.45 ku,等电点为6.29,富含α螺旋和随机卷曲,含多个蛋白激酶磷酸化位点,1个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点和1个豆蔻酸位点. 结论 Sj雌虫免疫血清可识别Sj特异性抗原分子,该抗原基因是否为雌虫性别特异性基因及其作为日本血吸虫病疫苗候选基因的价值,有待进一步研究.
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刺毛虫毒刺cDNA文库的构建及初步分析
目的 构建刺毛虫毒刺的cDNA文库,克隆其毒素编码的基因.方法 提取刺毛虫毒刺中的总RNA;使用clontech公司的cDNA文库构建试剂盒进行反转录,长距离PCR方法合成第二条链,酶切纯化后与载体连接,电转化入感受态细胞XL1-Blue,通过抗性筛选后进行菌落PCR鉴定,挑选插入子在300 bp以上的单克隆送至测序公司测序.结果 成功构建了刺毛虫毒刺cDNA文库,初步鉴定其插入子长度为250～1 000 bp.结论 刺毛虫毒刺cDNA文库构建成功,并获得大量的编码刺毛虫毒素的全长基因,为研究其致病机制奠定了基础.
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HBsAg诱饵载体的构建、表达及人胰腺cDNA文库的扩增、纯化和转化
目的 构建HBsAg诱饵真核表达载体,并在AH109酵母菌中进行表达,同时扩增、纯化、鉴定及转化人胰腺cDNA文库.方法 通过PCR扩增HBsAg基因,克隆到pGEM-T载体,测序正确后酶切并连接至表达载体pGBKT7中,转化酵母菌AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp/Kana)上筛选阳性菌落,提取重组蛋白,经SDS-PAGE电泳后进行Western blot分析.扩增、纯化人胰腺cDNA文库并进行酶切鉴定及生物信息学分析,醋酸锂法将其转入Y187酵母菌.结果 成功构建酵母表达载体pGBKT7-HBsAg、SDS-PAGE和Western blot显示重组蛋白在酵母细胞中正确表达；成功构建人胰腺cDNA文库,其容量为4×109CFU/L,插入片段大小为0.5～2.0 kb,长度不均,重组率为100％.结论 成功构建HBsAg真核载体并在AH109酵母菌中表达,同时获得高质量的胰腺cDNA文库并转化入Y187酵母菌,为通过酵母双杂交筛选与HBsAg相互作用蛋白基因奠定了基础.
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广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA文库的构建及免疫学筛选
目的 构建广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA文库,免疫学筛选抗原基因.方法 提取广州管圆线虫Ⅴ期幼虫总RNA,用Clonteeh公司的SMART~(TM)cDNA文库构建试剂盒构建未扩增文库,检测未扩增文库滴度和重组率后,进行文库扩增.用大鼠感染血清作免疫探针筛选文库,PCR扩增外源基因插入片段并测序,用生物信息学软件进行同源性比对,推导氨基酸序列,预测其理化性质.结果 成功构建了广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA文库,免疫学筛选获得11个阳性克隆,对测序的9个阳性克隆进行初步分析,1个与广州管圆线虫Ⅴ期幼虫的1个EST同源性为99%,6个(有2个为同一克隆)与秀丽隐杆线虫和新杆状线虫均有不同程度的同源性,高达91%.共有7个阳性克隆存在完整的开放阅读框.结论 从广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA文库中初步筛选出7个有诊断意义的抗原基因,为其相关研究奠定了基础.
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应用酵母双杂交技术筛选与pGBKT7-CT813编码产物相互作用蛋白的研究
目的 以pGBKT7-CT813作为诱饵质粒与HeLa细胞酵母GAL4 AD融合cDNA文库进行酵母双杂交试验,以进一步探讨沙眼衣原体包涵体膜蛋白的生物学功能. 方法 根据STD基因库提供信息设计引物,用PCR法获取目的基因片段CT813,经酶切处理的CT813和pGBKT7质粒,在T4连接酶作用下连接,连接产物转入感受态细胞BL21,培养后进行菌落PCR验证,对阳性质粒进行测序分析.质粒转化入酵母菌株Y187和AH109中,检测其有无自激活及毒性作用.阳性重组酵母菌株AH109与cDNA文库菌株Y187进行配合,待三叶草(或米奇)形状合子形成后涂布于腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸、色氨酸缺陷型培养基和铺有X-Gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上初筛,再经过2次筛选,收集阳性菌落.将阳性菌液点种在滤纸上,在液氮中反复冻融2次,然后浸泡在Z缓冲液-β巯基乙醇-X-Gal混合液中室温温育8h.对筛选出的显色阳性菌液进行PCR验证.选取22个PCR阳性菌液提取酵母质粒,将22个质粒再转入感受态细胞E.coli,BL-21,对阳性菌落提取质粒,进行回交试验,对验证阳性的菌落对应的质粒进行测序. 结果 成功构建了pGBKT7-CT813诱饵质粒,该质粒的表达产物对AH109和Y187均无自激活和毒性作用.将回交试验筛选的阳性菌落对应的质粒进行测序,对测序结果做BLAST检索分析,确定筛选出与pGBKT7-CT813特异性相互作用的基因可能编码的蛋白是:半乳糖凝集素-1(LGALS1)、环腺苷酸应答原件结合蛋白3(CREB3)、核糖体核糖体蛋白L10a(RPL10a)和微管蛋白37E-16(RP1-37E16). 结论 筛选出的4种蛋白可能与沙眼衣原体的致病机制相关,但仍需要进一步验证.pGBKT7-CT813编码产物与多种蛋白有相互作用,为进一步研究其生物学功能打下了基础.
关键词： pGBKT7-CT813 cDNA文库 酵母双杂交
