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早孕因子的研究现状及进展
早孕因子(early pregnancy factor, EPF)是目前早确认妊娠的生化标志之一.EPF初发现于孕鼠血清,它在孕血中的出现具有妊娠特异性,被认为是热休克蛋白家族成员伴侣蛋白10(cpn 10)的同系物,在细胞外发挥效应,具有免疫抑制和生长因子的作用,嗣后发现它还对损伤修复过程及一些恶性肿瘤的生长起到支持作用.但由于其检测方法玫瑰花环抑制试验的复杂性及检测效率低等问题,EPF的应用受到了极大限制.近年随着单克隆抗体(McAb)技术的不断进展,EPF的高效检测成为可能.我们希望能够制备出EPF特异性McAb,用于超早孕诊断,以及流产和某些恶性肿瘤的早期诊断及预后判断.
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早孕因子生物学活性的研究现状和应用前景
早孕因子(early pregnancy factor,EPF)是一种具有免疫抑制和生长调节作用的妊娠相关蛋白.因为它具有免疫抑制性,可抑制玫瑰花环形成,故通常用玫瑰花环抑制实验来检测.有报道EPF与分子伴侣10(Cpn10)有同源性,但它们又不完全相同,Cpn10在细胞内与Cpn60特异性结合辅助蛋白质正确折叠,EPF则作为细胞外蛋白发挥作用.实验表明除孕血清外,在患肿瘤的病人和动物血清中、小鼠肝脏部分切除后的鼠血清中也检测到了EPF,这说明它除了免疫抑制性外,还具有类似生长因子的作用.因此它在临床有很广泛的用途,本文就EPF的生物学活性及其在临床工作上的研究和应用前景做一综述.
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早孕因子在妇产科领域的研究进展
早孕因子(early pregnancy factor,EPF)是受精后从母体血清检测出的与妊娠相关的蛋白之一.1974年由澳大利亚学者Morton等在孕鼠血清中首次发现,并命名为早孕因子.EPF作为具有免疫抑制活性和生长调节活性的妊娠相关蛋白,目前被认为是早能确认妊娠的生化指标之一.本文总结了多年来EPF来源、本质、作用机制、应用等方面的研究进展,希望能促进EPF在医学领域尤其是妇产科医学方面的深层次应用.
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超早孕妇女血中早孕因子／chaperone10预示胚胎的存活
早孕因子（EPF ）／chaperone10是妊娠早期分泌的具有免疫抑制作用和生长因子作用的蛋白质，在授精12～48 h后就可利用玫瑰花结抑制实验（RIA）在妊娠血清中检测到。EPF早是由Mor‐t o n等［1］在1974年描述，产生于授精后植入前，存在于妊娠早期。已经从人、猪、牛［2］、羊、红鹿等［3］哺乳动物妊娠血清和妊娠妇女子宫颈黏液中检测出了EPF活性。我们报道了可以从滋养细胞肿瘤患者体内测出EPF 活性。
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"人流血"中早孕因子的分离、纯化及鉴定
目的分离、纯化并鉴定"人流血"中的早孕因子.方法采用DEAE纤维素离子交换层析,S-Sepharosefastflow离子交换层析,ConA-SepharoseCl4B亲和层析,Heparin-SepharoseCl6B亲和层析等方法进行纯化.用花结抑制实验检测出其活性.以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其肽图.以等电聚焦电泳法检测其等电点.结果从人流血中分离出EPF活性样物质,其蛋白含量为0.375mg/ml,SDS-PAGE见1条均匀带,其相对分子质量为26500,等电点为6.87.结论本研究提取的早孕因子性质与国内外报道的从妊娠初期孕妇血清中提取的基本一致.
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胚胎围植入期超早孕妇女血中早孕因子的分离纯化
目的 分离纯化围植入期超早孕妇女血清中免疫抑制物质——早孕因子(early pregnancy factor,EPF).方法 挑选取超声波监测的排卵受精后1到8d内的山西太原妇女40名,抽取血液20-40mL,RIT检测EPF活性,对收集的400 mL胚胎植入期妇女血清,经过DEAE Sepharose离子交换层析,Con A Sepharose 4B亲和层析以及Heparin Sepharose CL-6B亲和层析进行了EPF的分离纯化.结果 受精后1-8天内的妇女血中可检测到EPF.EPF可以被纯化为相对分子质量为18000的单一条带.结论 胚胎围植入期超早孕妇女血中EPF蛋白质的分离和纯化,为EPF的研究,尤其是围植入期免疫抑制作用,避免了母亲的免疫系统对半移植物胚胎的排斥的研究提供了理论和应用价值.
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重组早孕因子与天然早孕因子的免疫交叉反应
目的:探讨细胞表达的重组早孕因子(CHO-EPF)、大肠杆菌表达的重组早孕因子(BL21-EPF)和天然早孕因子(Native EarlyPregnancy Factor,nEPF)之间的免疫交叉反应,寻找制备EPF抗体比较理想的免疫原.方法:采用CHO-EPF、nEPF作为免疫原分别免疫BALB/c小鼠,制备CHO-EPF多抗和nEPF多抗;结合本实验室储备的BL21-EPF鼠单克隆抗体,运用SDS-PAGE、Westernblotting及ELISA等方法对nEPF、CHO-EPF、BL21-EPF之间的免疫交叉反应进行检测.结果:三种来源的EPF诱导抗体的效价比较无显著性差异.原核表达BL21-EPF与nEPF诱导的抗体中BL21-EPF单抗能识别nEPF中26 ku和52 ku组分,且抗nEPF多抗也能与BL21-EPF中10ku组分反应;真核表达CHO-EPF与nEPF诱导的抗体中CHO-EPF多抗能识别nEPF中10ku和26 ku组分,而nEPF抗体不能与CHO-EPF反应;原核表达BL21-EPF与真核表达CHO-EPF诱导的抗体中CHO-EPF多抗能识别BL21-EPF中10ku片段,而BL21-EPF单抗不能与CHO-EPF反应.结论:真核源性CHO-EPF、原核源性BL21-EPF、人源性nEPF之间存在一定的交叉反应,在抗体制备过程中用rEPF替代nEPF作为免疫原是可行的.
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聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法测定早孕因子的等电点
早孕因子是存在于妊娠早期母体血清中的一种免疫抑制因子,作为受精后早被检出且具有免疫调节活性的物质日益受到关注.我们从人工流产的血液中提取出早孕因子活性样物质.用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法测定其等电点.此方法操作简便,结果准确可靠,实验耗时短,无需昂贵仪器.1材料与方法[1-3]
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双单抗夹心ELISA方法检测EPF活性
目的建立双单抗夹心酶联免疫吸附试验法用于测定早孕因子(EPF).方法筛选可稳定分泌抗EPF单克隆抗体的细胞株,制备腹水型单抗(McAb)并分离纯化,用改良碘化钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗,分析McAb的结合位点,通过抗体配对试验选择合适的捕获和检测McAb,建立双McAb-ELISA检测方法.结果筛选出二株稳定分泌抗EPF抗体的单克隆细胞株;两株单抗识别不同的抗原表位;双McAb夹心ELISA法测EPF活性灵敏度可达0.01 ug/ml,线性测定范围在0.01～10 ug/ml,2份同批血清标本分别重复8次测定,平均批内变异系数为7.7%,2份不同批血清分别重复6次测定,平均批间变异系数为5.8%.建立的双McAb-ELISA法灵敏度90.2%和特异度为92.8%.结论建立的双McAb夹心ELISA法,有优异的灵敏度和特异度,稳定性强,而且简便、快速,适用于血清EPF检测,并有一定的临床应用前景.
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鼠抗早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备鼠抗早孕因子(EPF)单克隆抗体,纯化并进行鉴定.方法 用重组EPF免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术获得抗EPF杂交瘤细胞株,注入BALB/c小鼠腹腔制备腹水型单抗,Protein-G亲和层析纯化后,SDS-PAGE电泳鉴定其纯度,用间接ELISA法测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,用Western blotting鉴定其特异性,并进行类及亚类、细胞染色体核型分析.结果 筛选出2株具有较高活性和良好稳定性的分泌抗EPF单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其腹水的抗体效价均高于2×10-5,2株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,2株单抗有不同的抗原表位.SDS-PAGE电泳显示纯化后抗体有较高的纯度,Western blotting表明其与EPF抗原有特异结合性.结论 成功制备2株具有较高活性的鼠抗EPF单克隆抗体,为建立检测EPF方法奠定了良好的基础.
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早孕因子分离纯化方法的优化
目的 对正常早孕妇女血清中早孕因子(EPF)的分离纯化过程进行优化,以提高EPF的回收率.方法 依次采用DEAEFast Flow离子交换色谱和Heparin Fast Flow亲和色谱,从妊娠12周内的正常早孕妇女混合血清中提纯EPF,采用活性玫瑰花结抑制试验(Ea-RIT)检测各阶段产物的EPF活性,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳鉴定纯化物并测定其相对分子质量,用Western blot鉴定其特异性.结果 经Ea-RIT检测后,DEAE Fast Flow离子交换色谱所现2峰中DE-Ⅰ峰为EPF活性峰,Heparin Fast Flow亲和色谱所现2峰中H-Ⅱ峰为EPF活性峰.H-Ⅱ峰收集液经SDS-PAGE电泳,结果显示为1条相对分子质量为38100的蛋白带,Western blot分析表明抗体与抗原匹配性良好.经检测其蛋白含量为0.615 mg,回收率为0.034％,与传统分离纯化四步法的回收率相比明显提高.结论 本优化方法对于提纯孕血清中的EPF是可行的,大大提高了纯化效率.
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抗早孕因子单克隆抗体的制备与鉴定
目的建立分泌抗EPF(Early pregnancy factor,早孕因子)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化单抗并鉴定.方法用本实验室已纯化的早孕和肿瘤源性EPF作为抗原刺激Balb/c小鼠,用免疫后的小鼠脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞(NS-1)融合,经4次克隆化,获得可稳定分泌抗EPF单克隆抗体的细胞株,注入Balb/c小鼠腹腔制备腹水型单抗,Protein-A亲和层析纯化,SDS电泳和Western-blot等方法分析纯化结果.结果融合后获得一株稳定分泌抗EPF抗体的细胞株(C3D11),克隆化后,获得稳定分泌抗EPF单克隆抗体的细胞株,将增殖后的细胞注射Balb/c小鼠腹腔获得腹水型单抗,以亲和层析法纯化,SDS-PAGE分析显示纯化后去掉了大部分杂蛋白,免疫印迹分析抗体纯度较高,与抗原匹配性良好.结论本研究制备的EPF单克隆抗体为特异性抗EPF抗体.
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早孕因子的研究进展
早孕因子是具有免疫抑制活性和生长调节活性的妊娠相关蛋白,为目前早确认妊娠的生化指标之一.目前普遍认为它是细胞伴侣蛋白10的类似物,但两者存在的部位及作用方式不同.除妊娠母体血清外,在某些肿瘤组织及再生肝细胞中也存在早孕因子,说明其还具有类似生长因子的活性.近年来随着早孕因子生化特性的逐步明确及其检测方法的改进,使得早孕因子在超早孕诊断、流产预测、某些肿瘤的早期诊断和预后判断及自身免疫性疾病的治疗等方面有了广泛的临床应用前景.
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缺失免疫抑制位点的人早孕因子重组蛋白的免疫原性
目的:构建缺失免疫抑制位点的人早孕因子基因的原核表达载体pGEX6P-EPF11,诱导GST-EPF11融合蛋白在大肠杆菌中表达,并免疫小鼠,测定效价.方法:以pMD18T-HSPE1模板,PCR扩增缺失免疫抑制位点的人早孕因子基因片段,经限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切后,连接到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达质粒pGEX6P-EPF11.将表达质粒转化大肠杆菌BL21,以1 mmol/L IPTG 进行诱导表达GST-EPF11融合蛋白,Western blot鉴定.以表达的GST-EPF11融合蛋白作为免疫原免疫小鼠,抗体效价用ELISA检测.结果:在大肠杆菌中成功表达出相对分子质量约35 000的融合蛋白GST-EPF11.ELISA法检测免疫小鼠的抗体血清可达1:12 800.结论:在大肠杆菌中成功表达出GST-EPF11融合蛋白,并免疫了小鼠,测定了抗体效价,为下步制备缺失免疫抑制位点的人早孕因子的单克隆抗体(mAb)奠定了基础.
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孕血清中早孕因子的分离纯化
目的:通过离子交换层析和亲和层析的分离方法从孕血清中得到纯化的早孕因子(EPF),为进一步制备单克隆抗体做准备.方法:采用依次经过DEAE 52阴离子交换层析,SP Sepharose F.F阳离子交换层析,Con A Sepharose 4B亲和层析和Heparin Sepharose Cl 6B亲和层析分离纯化方案,终得到具有早孕因子活性的Heparin-Ⅱ成分,早孕因子活性采用活性玫瑰花环抑制实验检测,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯化物.结果:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示两条带,相对分子量分别为46.30 kDa和10.71 kDa.结论:经过四步层析得到较纯的EPF样品,并认为EPF在血清中可以以单体和多聚体形式存在.
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孕牛血清中早孕因子的生化特性研究
目的：探讨孕牛血清中早孕因子(EPF)的生化特性。方法：对孕牛(妊娠45个月)血清进行标准化处理，采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose、CM-Sepharose柱层析、玫瑰花环抑制滴度试验、SDS-PAGE和等电聚焦等技术对EPF进行生化特性的研究．结果：在孕牛血清中分离出分子量分别为21、67kD两条区带的蛋白质，以21kD区带蛋白质活性强，其等电点为6．80。结论：孕牛血清中存在着分子量为21、67kD的蛋白质，均具有EPF特性，21kD蛋白等电点为6．80。
