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荧光定量 PCR 与半定量 PCR 检测猕猴不同器官组织中黄嘌呤脱氢酶／氧化酶基因的mRNA 表达差异的比较
目的：比较荧光定量PCR 与半定量PCR 检测猕猴体内肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织，肾脏组织中黄嘌呤脱氢酶氧化酶（ XDH／XO）的mRNA的相对表达量的差异，为改进实验研究方法学提供参考依据。方法提取健康猕猴新鲜肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织，肾脏组织中总RNA，使用相同的引物序列及内参基因，分别用荧光定量PCR与半定量PCR进行相对定量检测，结果做比对分析。结果两种检测方法均能检测到健康猕猴新鲜肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织，肾脏组织中XDH／XO的mRNA表达，荧光定量PCR灵敏度可检测到肝脏组织0．4ng总RNA中的XDH／XO的mRNA表达，半定量PCR灵敏度可检测到肝脏组织15．625 ng总RNA中的XDH／XO的mRNA表达，荧光定量PCR较半定量灵敏度高39倍。两种方法检测结果均显示猕猴不同组织XDH／XO的mRNA表达在肝脏组织中表达水平高，对于表达量较低的其他组织，荧光定量PCR与半定量PCR检测结果存在有一定差异。结论两种方法均可用于检测猕猴体内肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织，肾脏组织中黄嘌呤氧化脱氢酶（ XDH／XO）的mRNA的相对表达量，荧光实时定量PCR灵敏度较高于半定量PCR法。
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半定量PCR检测致龋性变形链球菌的技术及应用
目的创建一种临床半定量检测致龋性变形链球菌的分子生物学方法.方法采用靶基因与参照基因同步扩增法,根据变形链球菌葡聚糖酶(dexA)基因序列,作者设计一对特异性引物,以pET23b质粒DNA为参照基因.对196名儿童的唾液样品进行半定量PCR检测并进行常规培养法的对比研究.结果 196份唾液样品半定量PCR检测致龋性变形链球菌大于等于105 CFU/ml(每毫升菌落形成单位)唾液的检出率为91.3%.与常规培养计量法的对比符合率为94.9%.结论变形链球菌PCR半定量检测是一种早期发现龋病活性的新方法,具有快速可靠,特异性强,符合率高等特点,故具有广泛的临床应用前景.
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神经型钙黏蛋白对小鼠脂肪间充质干细胞的成神经作用
目的:探讨神经型钙黏蛋白(N-cadherin)在小鼠脂肪间充质干细胞(ADMSCs)成神经分化中的作用.方法;用差速培养法获取小鼠ADMSCs,传至第5代,经成神经诱导液诱导ADMSCs 7 d后,免疫荧光检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和微管相关蛋白2(MAP2)的表达,半定量PCR检测细胞中N-cadherinmRNA的表达;采用N-cadherin对细胞进行基因修饰,免疫荧光检测神经丝蛋白(NF)和GFAP的表达.结果:ADMSCs经成神经诱导7d后表达GFAP、NSE和MAP2,半定量PCR结果显示,与对照组相比成神经诱导后的细胞表达N-cadherin显著增高.转染N-cadherin的N-cadherin细胞培养24h后发出细长的突起,与相邻细胞之间形成网状连接.免疫荧光结果显示,转染后的细胞NF和GFAP表达阳性.结论:ADMSCs在体外多种作用下,具有向神经细胞分化的潜能.N-cadherin转染后能改变ADMSCs的形态,并且在ADMSCs向神经分化中发挥一定的作用.
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四种小型猪内源性逆转录病毒基因研究
目的 检测四种小型猪在内源性逆转录病毒基因(PERV)拷贝数上的差异,试图找出不舍或含有较低拷贝数的个体或品种.方法 采用半定量PCR方法检测了我国四种小型猪内源性逆转录病毒基因的拷贝数.结果 贵州小型猪、五指山猪、西藏小型猪、巴马小型猪的PERV的拷贝数分别是34.12±16.96,29.38±13.83,28.71±14.11,27.12±14.43(F=0.614,P=0.609),EnvA的拷贝数分别是9.78±5.48,10.06±5.34,10.23±5.71,10.51±6.23(F=0.044,P=0.988),EnvB的拷贝数分别是24.14±11.26,20.72±8.36,18.35±8.50,17.60±8.65(F=1.512,P=0.221).尚不能认为四个猪种间PERV、EnvA、EnvB的拷贝数之间的差异具有统计学意义.结论 四种常用的小型猪内源病毒负载量较低,表明其用于异种器官移植研究的可行性.
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氯化两面针碱对斑马鱼胚胎血管生成的影响
目的 观察氯化两面针碱对斑马鱼胚胎血管生成的影响,并探讨其可能作用机制.方法 前期实验基础上设计4个药物浓度组(8.19、10.24、12.80、16.00 mg·L-1),含等量助溶剂DMSO为空白对照组,通过NBT/BCIP血管染色法观察氯化两面针碱对72 hpf斑马鱼胚胎肠下静脉血管发育的影响;半定量RT-PCR法检测血管生成相关基因表达变化.结果 氯化两面针碱剂量依赖性抑制斑马鱼胚胎肠下静脉血管生成,下调血管生成相关基因VEGF、VEGFR-2和FGF2的表达.结论 氯化两面针碱可以抑制斑马鱼胚胎血管生成,可能机制与影响VEGF、VEGFR-2和FGF2的表达有关.
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不同表型表皮葡萄球菌之间的相互作用及LuxS基因对生物膜形成的影响
目的探讨不同表型的表皮葡萄球菌( SE)之间的相互作用机制以及luxS基因在SE形成生物膜过程中所起的作用。方法分别应用 TSB培养液、ATCC12228上清液以及ATCC35984上清液培养产生生物膜的 SE 标准菌株ATCC35984和不产生生物膜的ATCC12228菌株,并采用半定量法检测细菌间多糖黏附素( PIA)以及半定量PCR法检测LuxS基因在该菌株中的表达。结果在TSB培养液中, ATCC35984菌株能形成致密完整的生物膜,而 ATCC12228菌株不能产生生物膜。在ATCC35984上清液中,ATCC12228菌株形成生物膜的能力增强, LuxS 基因表达降低。在ATCC12228菌株上清液中, ATCC35984产生生物膜能力下降,LuxS基因表达增强,两者比较差异均有统计学意义( P<0.05)。结论LuxS基因在SE形成生物膜的过程中起一定作用,并且不同表型的SE之间存在相互影响的现象。
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转染野生型DNA聚合酶β基因对交链孢霉酚毒性作用的影响
目的 观察转染野生型DNA聚合酶β(DNA polβ)基因对交链孢霉酚(AOH)诱导NIH3T3细胞DNA polβ表达量改变的影响.方法 用pEGFP-C3、pEGFP-C3-polβ质粒转染NIH3T3细胞;将转染pEGFP-C3和pEGFP-C3-polβ的NIH3T3细胞分别用1.5μmol/L、2.0μmol/L和2.5 μmol/L 3种浓度的AOH诱导48 h后,RT-PCR同时扩增DNA polβ基因和β-actin基因,进行半定量分析.结果 在AOH作用下,横向比较发现,3种细胞鼠polβ表达量都有升高的现象,且AOH浓度越高,表达量升高的越明显;但经纵向分析发现,在同样浓度的AOH诱导下,转染野生型的polβ的NIH3T3细胞的鼠polβ升高的程度较未转染的NIH3T3细胞和转染空载体的NIH3T3细胞鼠的表达量低(P＜0.05).结论 高表达野生型DNA polβ具有一定程度的抵抗霉菌毒素这种诱变剂致使NIH3T3细胞DNA polβ表达量升高的作用.
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中药中的霉菌毒素对细胞内基因修复系统的影响
目的 观察中药中霉菌毒素对NIH/3T3细胞中DNA聚合酶β(DNApolβ)表达量的影响,研究中药不良反应的机制和互隔交链孢酚致细胞变异的机制.方法 体外培养NIH/3T3细胞,用不同浓度的霉菌毒素——互隔交链孢酚(AOH)加入培养液影响细胞.用RT-PCR方法从细胞全RNA中扩增出DNA聚合酶β基因cDNA序列,同时扩增β-actin进行半定量分析了解其表达量的变化.结果 成功从NIH/3T3细胞中扩增了DNA聚合酶β基因cDNA,通过半定量分析发现随着药物浓度的增高,DNA聚合酶β表达量上调.结论 霉菌毒素可导致细胞中的DNA聚合酶β表达量上调从而影响基因修复系统的功能,AOH的作用浓度越高,DNA聚合酶β基因表达量越高.
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硼等4种元素对甘草酸生物合成关键酶基因表达的RT - PCR分析
目的 研究B、Mn、Zn和Mo等4种微量元素对甘草酸生物合成关键酶鲨烯合成酶(SQS)和β-香树脂醇合成酶(β-AS)基因表达的影响.方法 设置上述4种微量元素0,0.05％,0.1％,0.15％和0.3％5个不同浓度水培乌拉尔甘草幼苗,9天后,取其根部半定量PCR检测.结果 能够促进SQS基因表达的是高和极高浓度的Zn元素(0.15％和0.3％)和中、高和极高浓度的Mo元素(0.1％,0.15％和0.3％)；Zn元素所有处理浓度均可明显提高β- AS基因的表达,随着Mo元素处理浓度的提高,β - AS基因的表达量增加.结论 Zn和Mo两种元素对乌拉尔甘草甘草酸生物合成关键酶基因表达有明显的促进作用.
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单核细胞趋化蛋白-1在种植体周围组织中的表达
目的：研究单核细胞趋化蛋白-1在不同种植体周围软组织和骨组织中的表达变化。方法：选用8只健康成年杂种狗，拔除双侧下颌第一、二、三前磨牙，3月后植入种植体。采用丝线结扎法建立狗实验性种植体周围炎模型，分别在丝线结扎后1周、2月和6月时处死实验动物，处死动物前记录牙周袋深度（PPD）、菌斑指数（PI）和改良龈沟出血指数（MBI），根据种植体周围炎症情况分健康组、炎症组和种植失败组。取种植体周围软组织用半定量RT-PCR法检测MCP-1 mRNA的表达，取种植体周围骨组织进行免疫组化染色，检测MCP-1的表达情况。用SPSS软件分析不同组别和不同时间点种植体周围软组织和骨组织中MCP-1的表达差异。结果：种植体周围软组织中MCP-1 mRNA的相对表达量在健康组较低（0．11±0．02），显著低于炎症组（0．24±0．05）和种植失败组（0．29±0．04），但炎症组和种植失败组无差别。实验组种植体1周MCP-1 mRNA的相对表达量开始增加，显著高于对照组，1月时高，但2月和6月时无明显差异。种植体周围骨组织中MCP-1的累积光密度值在健康组（412．36±42．11）低于炎症组（1134．89±56．47）和种植失败组（1345．65±46．23），实验组种植体MCP-1的表达从基点后2月开始增加，对照组无明显变化。结论：MCP-1在种植体周围软组织和骨组织中均有表达，但变化不同步；MCP-1能反映种植体周围软组织的炎症状况，但与种植体周围骨吸收的关系还需进一步研究。
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半定量PCR检测致龋性变形链球菌技术及应用
目的创建一种临床半定量检测致龋性变形链球菌的分子生物学方法.方法采用靶基因与参照基因同步扩增法,根据变形链球菌葡聚糖酶(dexA)基因序列,作者设计一对特异性引物,以pET23b质粒DNA为参照基因.对196名儿童的唾液样品进行半定量PCR检测并进行常规培养法的对比研究.结果196份唾液样品半定量PCR检测致龋性变形链球菌≥105 CFU/ml唾液的检出率为91.3%.与常规培养计量法的对比符合率为94.9%.结论变形链球菌PCR半定量检测是一种早期发现龋病活性的新方法,具有快速可靠,特异性强,符合率高等特点,故具有广泛的临床应用前景.
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WISP-2在人脑星形细胞瘤中的表达研究
目的 探讨WISP-2 mRNA及蛋白在人脑星形细胞瘤中的表达及意义.方法 采用半定量PCR检测WISP-2mRNA在人脑星形细胞瘤组织与正常脑组织中的表达差异;随后利用免疫组化方法验证WISF-2蛋白在星形细胞瘤组织与正常脑组织之间的表达差异.结果 半定量PCR检测发现,WISP-2 mRNA在正常脑组织中无表达,在星形细胞瘤中相对表达量为0.677±0.445,两者比较有统计学意义(t=4.783,P<0.05).在高级别组(Ⅲ-Ⅳ)与低级别组(Ⅰ-Ⅱ)星形细胞瘤中的相对表达量分别为0.924±0.438、0.478±0.344,两者比较有统计学意义(t=3.909,P<0.05).免疫组化检测发现,正常脑组织细胞中无WISP-2蛋白阳性表达(0/10),WISP-2蛋白在星形细胞瘤组织内呈高表达,阳性率为66.0%(31/47),两者比较有统计学意义(x2=11.92.P<0.01),WISP-2蛋白在高级别组(Ⅲ一Ⅳ)与低级别组(Ⅰ-Ⅱ)星形细胞瘤中的表达阳性率分别为85.7%(18/21)、50.0%(13/26),两者比较有统计学意义(x2=6.60,P<0.05),与WISP-2 mRNA在星形细胞瘤组织内表达特征相一致,两者具有正相关性(r=0.63,P<0.001).结论 WISP-2 mRNA和蛋白在人脑星形细胞瘤组织中明显高表达,并与其恶性程度有关,可作为判断脑星形细胞瘤恶性程度的一个辅助指标.
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PINCH mRNA在乳腺癌中的表达意义及其与Nup88的相关性研究
目的 研究PINCH mRNA在乳腺癌组织中的表达及其与Nup88的关系.方法 采用半定量PCR法检测PINCH mRNA及Nup88 mRNA在乳腺癌及乳腺良性肿瘤组织中的表达.结果 PINCH mRNA在乳腺癌组织中的表达水平(0.725±0.060)较乳腺良性肿瘤组织中的(0.497±0.04)明显增高(P＜0.001).且在乳腺癌组织中PINCH mRNA的表达与患者年龄、肿瘤部位以及组织学分类无关(P＞0.05),与组织学分级、TNM分期及淋巴结转移有关(P ＜0.05);PINCH mRNA在乳腺癌组织中的表达与Nup88的表达呈正相关(P＜0.05),相关系数为0.325.结论 PINCH mRNA与乳腺癌的发生、发展及转移有关,联合检测PINCH及Nup88对进一步理解乳腺癌的生物学行为及判断预后有一定的价值.
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荧光定量 PCR与半定量PCR检测HBV DNA的对比分析
目的:对照分析荧光定量PCR与半定量PCR检测血清HBV DNA的载量,为临床基因检测实验室提供方法学选择依据. 方法: 取164份临床检测标本各用荧光定量PCR与半定量PCR检测,结果作统计学分析. 结果: 两种检测方法的灵敏度和特异度没有显著差异(χ2 =1.75,P>0.05). 结论: 临床基因检测实验室可用半定量PCR法替代荧光定量 PCR法检测血清HBV DNA的载量.
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强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞的组蛋白甲基化
目的 探讨强直性脊柱炎(AS)患者外周血单个核细胞(PBMC)组蛋白修饰情况.方法 收集27例AS患者及22例健康对照者的静脉血;分离PBMC,采用H3 K4、H3K9甲基化检测试剂盒提取组蛋白和检测H3K4、H3K9甲基化水平;半定量PCR法检测AS患者的PBMC组蛋白甲基转移酶基因(SETI、SUV39H1和SUV39H2)的mRNA表达水平;ELISA分析外周血白细胞介素(IL)-23、IL-17和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达水平.结果 与健康对照者比较,AS患者PBMC组蛋白H3K4甲基化水平显著升高(P＜0.05),而两者组蛋白H3K9甲基化水平比较差异无统计学意义(P＞0.05);半定量PCR结果显示AS患者PBMC的SET1和SUV39H1基因表达水平分别是健康对照者的1.73和0.68倍(P＜0.05),而两者PBMC的SUV39H2基因的表达水平比较差异无统计学意义(P＞0.05);AS患者中IL-23、IL-17、TNF-α的蛋白表达水平显著高于健康对照者(P＜0.05,P＜0.01);AS患者PBMC组蛋白H3K4甲基化水平与血清中IL-23、IL-17和TNF-α蛋白表达水平均呈正相关(P＜0.05).结论 AS患者外周血PBMC组蛋白甲基化呈现异常,且与AS发生发展有一定的相关性.
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交链孢酚对成纤维细胞中DNA聚合酶β的影响
目的 观察霉菌毒素的致癌机制是否与其影响了细胞内的基因修复系统相关.方法 体外培养成纤维细胞NIH/3T3细胞系,在培养液中加入16μM的互隔交链孢酚作用后,提取细胞全RNA,进行半定量分析了解其表达量的变化,RT-PCR扩增DNA聚合酶β基因cDNA序列,克隆至T载体后测序,分析其序列变化.结果 克隆成功并测序后发现有DNA聚合酶β基因序列的两个位点发生突变.同时,通过半定量分析发现DNA聚合酶β表达量逐渐上调.结论 AOH可导致NIH/3T3细胞中的DNA聚合酶β发生点突变、表达量上调.
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木瓜提取物的抗炎活性研究
目的 研究不同部位木瓜提取物在细胞水平上的抗炎作用及机制.方法 依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取已用65％乙醇抽提的木瓜粉末,得到乙酸乙酯、正丁醇及水溶性部位提取物;建立THP-1及L929细胞炎症模型,用MTr法检测3个部位提取物的抗炎活性.利用核转录因子(NF-κB)报告基因系统检测NF-κB的活性,并用半定量PCR检测药物处理后细胞内炎症反应相关基因的表达.结果 与对照组比较,用乙酸乙酯部位处理后的THP-1细胞内Toll样受体及其下游炎症因子的表达水平明显下降,且用该组上清液处理后的L929细胞的活细胞数明显高于其他组.结论 木瓜的乙酸乙酯部位提取物具较好的抗炎效果.
