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原代培养海马神经元Drebrin和Synaptophysin的表达与动态变化
目的:观察原代海马神经元不同时期树突棘的变化以及树突棘蛋白Drebrin和突触囊泡膜蛋白SYN的表达水平.方法:光镜观察原代培养7、14和20 d的海马神经元的形态改变.应用免疫荧光对Drebrin和SYN进行染色,观察树突棘形态和数量的改变.进一步应用Western Blot检测Drebrin和SYN蛋白的表达变化.结果:培养7d的海马神经元,未见树突棘结构,SYN斑点状阳性产物较少.随着海马神经元培养时间的加长,突起数量逐渐增加,14 d和20 d的树突棘数量和SYN阳性产物均显著增加.Drebrin和SYN蛋白表达水平也随培养时间的加长而显著增加.结论:原代培养的海马神经元在14 d已有树突棘形成,20 d显示出成熟树突棘的形态和数量.Drebrin和SYN的蛋白表达水平反映了树突棘和突触的形成和功能状态.
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改良的胎鼠海马神经元原代培养及模拟糖尿病并发抑郁环境对其的损伤作用
目的:建立一种改良的胎鼠海马神经元原代培养方法,研究模拟糖尿病并发抑郁(diabetes mellitus with depression,DD)环境对其的损伤作用.方法:取胎龄18 d的SD大鼠,体视显微镜下分离海马,0.25％胰蛋白酶和0.2％胶原酶(1∶1)消化后进行体外培养,分别观察培养后4h、24h、5d、8d、14 d海马神经元的基本形态结构;神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)免疫细胞化学染色进行细胞鉴定.采用高糖联合皮质酮造模构建类似糖尿病并发抑郁症状的模拟DD环境,MTT法检测神经元的存活率;流式AnnexinV/PI双染和Hoechst荧光染色检测神经元的凋亡情况.结果:经NSE免疫细胞化学鉴定,培养7d后的神经元纯度达95％以上,细胞胞体成球形,树突分支明显,并相互交织成丰富的神经网络;高糖、皮质酮及两者联用造模18 h后,与正常对照组相比,MTT检测细胞存活率分别为53.1％、64.3％和56.7％,P＜0.05;流式细胞仪检测正常对照组、高糖组、皮质酮组、两者联用组Q3区的比例(分别为71.6％、47.9％、53.6％和39.2％),明显低于阴性对照组(98.5％),P ＜0.05.后四者Q2+Q4区总比例分别为24.4％、46.6％、40.4％、67.0％;Hoechst染色结果提示上述三个造模组的神经元细胞核均出现不同程度的核染色质聚集、浓缩,甚至核碎裂,呈现出典型的凋亡特征.结论:成功建立一种操作简便、细胞纯度佳、活性好、产率高的胎鼠海马神经元原代培养方法,验证了模拟DD环境对海马神经元的损伤作用,为体外深入研究DD的发病机制及药物防治提供了实验依据.
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外源性硫化氢保护实验性癫痫持续状态大鼠海马神经元作用的研究
目的:为研究外源性硫化氢(H2S)对实验性癫痫持续状态(status of epilepticus,SE)大鼠海马神经元的保护作用,我们用供体NaHS对氯化锂-匹罗卡品所致幼鼠SE海马神经元的影响,并对SE引起的脑损伤进行靶点干预.方法:用氯化锂-匹罗卡品建立大鼠SE模型,并分为正常+NaHS组,癫痫组,癫痫+NaHS组和癫痫+羟胺组,另设正常组(对照组),每组6只.用比色法测定血浆和海马H2S浓度,用Real-Time PCR检测海马胱硫醚-β合酶(CBS)基因mRNA表达,用HE染色和Nissl染色观察海马神经元形态.结果:癫痫组血浆和海马组织H2S浓度和CBS mRNA表达明显低于正常组(P＜0.01),癫痫+NaHS组血浆和海马组织H2S浓度和CBS mRNA表达明显高于癫痫组(P＜0.01),癫痫+羟胺组血浆和海马组织H2S浓度和CBS mRNA表达显著低于癫痫组(P＜0.05).HE染色显示,癫痫组海马CA3区锥体细胞明显减少,细胞层次紊乱,形态不规则;尼氏染色显示,癫痫组海马CA3区尼氏体明显减少,锥体细胞排列紊乱;与癫痫组比较,癫痫+NaHS组海马尼氏体缺失和锥体细胞排列紊乱明显改善.结论:外源性H2S对实验性癫痫持续状态大鼠海马组织CBS mRNA表达具有上调作用,并提高血浆和海马组织H2S含量.同时,外源性H2S对实验性癫痫大鼠海马组织神经元具有保护作用.
关键词： 癫痫持续状态 硫化氢 海马神经元 胱硫醚-β合酶基因mRNA 大鼠 -
DKK1对慢性吗啡和纳洛酮处理的培养海马神经元树突棘的影响
目的:探讨DKK1作为Wnt通路的抑制剂在吗啡依赖和纳洛酮戒断导致的神经元树突棘发育异常中是否起到一定的保护作用.树突棘是生长在神经元树突上的棘状突起,树突棘的生长与神经元突触可塑性有密切关系.方法:在原代培养的海马神经元上建立慢性吗啡依赖和纳洛酮戒断等模型,运用免疫荧光技术检测神经元树突棘的变化,Western Blot技术和免疫荧光技术检测Wnt通路关键蛋白β-catenin的变化.结果:在慢性吗啡依赖组以及慢性吗啡依赖和纳洛酮戒断组,β-catenin的表达增加并且神经元树突棘发生了明显丢失,而Wnt通路阻断剂DKK1在降低神经元内β-catenin的表达的同时对神经元树突棘的丢失起一定的抑制作用.结论:DKK1通过抑制Wnt通路对吗啡依赖所导致的海马神经元树突棘的丢失有一定作用.
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炎症因子对原代培养海马神经元CLC-3表达的影响
目的:研究不同浓度TNF-α、IL-1β、TGF-β刺激对原代培养海马神经元CLC-3(voltage-gated chloride channel 3)mRNA及蛋白质水平的影响.方法:取原代培养8d的大鼠海马神经元,随机分为对照组、TNF-α组、IL-1β组和TGF-β组.TNF-α、IL-1和TGF-β组分别加入加入含有浓度为10ng/ml的相应炎症因子培养液,每组分别在孵育6、12、24h后分别收集细胞提取总RNA和蛋白采用实时定量PCR、Western Blot技术检测CLC-3 mRNA及蛋白水平的表达.结果:TNF-α、IL-1β处理12h后培养海马神经元CLC-3在mRNA及蛋白水平开始上调,高峰持续从12h至24h(P＜0.05).TNF-α刺激作用强于IL-1β.TGF-β处理海马神经元CLC-3mRNA在6h后即开始升高(P＜0.05),但在孵育6h到24h时下降至正常对平(P＞0.05).结论:TNF-α、IL-1β、TGF-β可能通过刺激海马神经元CLC-3表达增加增强神经元存活能力.
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红景天苷类似物MADP对谷氨酸诱导的大鼠海马神经元凋亡的保护作用
目的:观察新型红景天苷(salidroside,Sal)类似物4-甲氧基苯甲基-2-乙酰氨基2-脱氧-β-D-吡喃糖苷(4-methoxy-2-acetamido-2-deoxy-β-D-pyranoside,MADP)对谷氨酸(glutamate)损伤海马神经元的保护作用.方法:原代培养大鼠胚胎海马神经元,与浓度分别为60、120、240 μmol/L的MADP或240 μmol/L的Sal共同孵育24 h,加入125 μmol/L谷氨酸损伤海马神经元15 min.使用相差显微镜观察海马神经元的形态变化;四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium salt colorimetry,MYT)比色法测定细胞活力;甲基百里香酚蓝(methyl thymol blue,MTB)法测定细胞内游离的钙离子浓度;采用实时荧光定量PCR技术检测细胞凋亡相关基因Bcl-2,Bax,Caspase-3的表达水平.结果:MADP或Sal预处理24 h可改善谷氨酸损伤后神经元胞体的肿胀和突起的淡化,抑制胞内游离钙离子浓度的上升,提升Bcl-2/Bax mRNA的表达水平,降低Caspase-3 mRNA的表达水平.MADP对大鼠海马神经元的保护作用优于Sal.结论:与Sal相比较,MADP更好的发挥了拮抗谷氨酸对海马神经元损伤的作用,其机制可能与抑制钙离子内流,上调Bcl-2/Bax mRNA及下调Caspase-3 mRNA的表达水平相关.
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NS398对Aβ肽损伤原代培养海马神经元的影响
目的:探讨Cox-2抑制剂NS398对损伤神经元的保护作用.方法:将原代培养的SD大鼠海马神经元随机分为空白对照组、Aβ肽细胞模型组和NS398实验组.以10 μmol/L Aβ25-35制作原代培养海马神经元损伤模型,以四氮唑溴盐(MTT)比色法检测细胞存活率,免疫细胞化学法检测Cox-2、Caspase-3的表达.结果:Aβ25-35细胞模型组神经元形态变化明显,细胞存活率明显下降,Cox-2和Caspase-3表达增强,与空白组比较有显著差异(P＜0.01).NS398使神经元细胞存活率明显提高并使Cox-2和Caspase-3表达减弱,与Aβ肽模型组比较具有显著性差异(P＜0.01).结论:Aβ25-35导致Cox-2和Caspase-3的表达增强,并使SD大鼠原代培养海马神经元变性、死亡.NS398可能通过抑制Cox-2和Caspase-3的表达保护原代培养海马神经元.
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卵巢移植对去势大鼠海马神经元数量和ER-β、NG表达的影响
目的:观察去势大鼠卵巢移植后海马神经元数量变化及雌激素受体β(ER-β)和神经颗粒素(NG)表达的变化,评价卵巢移植对中枢神经的保护作用.方法:成年雌性SD大鼠行双侧卵巢切除术(OVX)后,在肾被膜下移植出生3日内乳鼠的卵巢,于干预后的4、7、14、21 d和28 d,通过Nissl染色计数海马神经元的数量,采用免疫组化法观察海马神经元ER-β和NG蛋白的表达情况,并与OVX组和正常对照组比较.结果:与OVX组相比,卵巢移植组随移植时间的延长,海马神经元的数量逐步恢复；ER-β和NG蛋白的表达在海马各区均有所升高(P＜0.05).结论:卵巢移植可以防止海马神经元数量的减少,并促进ER-β和NG表达,发挥雌激素对中枢神经系统的保护作用.
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新生大鼠离体海马神经元原代培养方法及鉴定
目的:建立一种稳定的生后大鼠离体海马神经元的培养方法.方法:无菌环境下将出生24 h内SD大鼠断头取脑分离海马,经消化后差速贴壁,采用无血清培养基进行培养,倒置显微镜下观察不同时间段细胞生长形态变化:采用Hoechst33258与NeuN抗体双染方法鉴定神经元.结果:采用差速贴壁后,使用无血清培养基培养的神经元生长良好,纯度较高,12 d时经鉴定神经元纯度可以达到92％以上.结论:差速离心法后可以采用无血清培养神经元,培养的神经元具有纯度高,结果稳定的优点,该方法为以后进行相关的研究奠定了基础.
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卵巢移植对去势大鼠海马神经元形态及BDNF表达的影响
目的:观察卵巢移植后大鼠海马神经元形态变化及BDNF的表达,评价卵巢移植对海马神经元的保护效果.方法:制作去势SD大鼠模型,卵巢移植干预组在其肾被膜下移植出生3d内的SD乳鼠卵巢,外源性激素干预组隔天给予腹腔注射乙烯雌酚1mg/kg.分别于干预后的4、7、14和28d,电镜观察海马神经元形态及免疫组化观察BDNF的表达情况.结果:卵巢移植后随着移植时间的延长血清雌激素和孕酮水平都逐步升高,乙烯雌酚组仅雌激素水平升高；各组海马神经元形态逐渐好转,移植14d和28d组海马神经元的形态改善优于同期给药组.卵巢移植组和乙烯雌酚组BDNF的表达在各区均有所升高,卵巢移植14d和28d组CA3区尤为明显(P＜0.05).结论:卵巢移植可以恢复卵巢内分泌功能,对海马神经元形态有改善作用及促进BDNF的表达,其神经元保护作用优于单纯乙烯雌酚干预组.
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大鼠胚胎原代海马神经元两种转染方法的比较
目的:原代海马神经元是原代细胞中比较难转染的细胞,为了得到比较高的转染效率,通过比较Li-pofectamine2000转染法和大鼠神经元核电转法(rat neuron nucleofector kit)转染效率及转染前后细胞的存活率,来探讨Nucleofector Kit核电转法的高效性.方法:选取胚胎18 d (E18)大鼠的海马神经元进行原代培养,获取海马神经元单细胞悬液后,于种植前和种植24 h后分别采用Nucleofector Kit和Lipofectamine 2000转染红色荧光蛋白(red fluorescence protein,DsRed)质粒.神经元转染48 h后分别采用轴突标记物Tau -1进行免疫荧光染色鉴定神经元.神经元的存活率采用台盼兰进行检测.结果:Lipofectamine2000的基因转染率仅为5.34％,而大鼠神经元Nucleofector Kit的转染率为44.54％,后者为前者的8.34倍.Lipofectamine2000转染细胞前后的存活率分别为98.56％和91.44％,而Nucleofector Kit组分别为98.26％和74.02％.结论:大鼠神经元核电转法能高效稳定的转染原代海马神经元.
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ATP诱导大鼠原代培养海马神经元神经毒性及对GAP-43表达的影响
目的:观察不同浓度ATP对大鼠原代培养海马神经元的损伤作用及GAP-43表达的影响,并探讨其可能机制.方法:原代培养新生SD大鼠海马神经元至第8d,MTT法检测不同浓度ATP作用下海马神经元的存活率,倒置相差显微镜观察海马神经元的形态学改变,免疫荧光细胞化学法观察损伤后海马神经元GAP-43的表达变化,钙离子荧光染料Flou-4/AM检测细胞内钙离子的浓度变化.结果:低浓度ATP对海马神经元无明显影响,高浓度ATP对海马神经元有毒性损伤作用,且呈剂量依赖性.P2X受体拮抗剂可阻断ATP介导的细胞毒性作用,但P2X7受体拮抗剂的阻断作用不明显.高浓度ATP作用海马神经元4h后,GAP-43的表达水平明显上调.且表达部位发生改变,主要表达于胞体,突起表达减少甚至消失.高浓度ATP组荧光衰减速率明显减慢,说明高浓度ATP参与了海马神经元细胞内钙调节.结论:高浓度ATP对海马神经元有毒性损伤j作用,损伤后GAP-43代偿性表达增多,且与细胞内钙离子浓度变化有关,P2X7受体可能不是介导ATP此作用的主要受体亚型.
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雷公藤内酯醇对AD细胞模型海马神经元凋亡的影响
目的:研究雷公藤内酯醇对阿尔茨海默病(AD)细胞模型海马神经元凋亡的影响,探讨雷公藤内酯醇治疗AD的可能机制.方法:用凝聚态Aβ1-40(20μg/ml)刺激的小胶质细胞条件培养液(MCM)作用于培养的大鼠海马神经元,建立AD细胞模型,应用MTT法和TUNEL染色,观察不同剂量的雷公藤内酯醇(5 μg/ml和25μg/ml)在不同时程(2 h和24 h)内对AD细胞模型海马神经元凋亡的影响.结果:加药后2 h除模型MCM组海马神经元凋亡数高于正常对照组和正常MCM组(P<0.05)外,其余各组之间海马神经元凋亡数无明显差异.加药后24 h,模型MCM组海马神经元凋亡数较正常对照组和正常MCM组显著增多(P<0.01);低剂量用药MCM组和高剂量用药MCM组海马神经元凋亡数与模型MCM组比较显著降低(P<0.05,P<0.01);高剂量用药MCM组海马神经元凋亡数较低剂量用药MCM组明显降低(P<0.01).结论:雷公藤内酯醇对AD细胞模型海马神经元的凋亡具有抑制作用.
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缺氧对大鼠海马神经元生物学功能的影响
为进一步探讨缺氧缺血如何诱导海马神经元损伤直至凋亡,明确缺氧对海马神经元生物学功能的影响及其相关机制,从而为缺血缺氧性脑病的防治提供实验依据,本研究以19 d的SD胎鼠脑作为取材对象,经过条件培养基纯化建立海马神经元原代培养体系,通过MTT法、TUNEL法、免疫荧光、化学发光等方法检测海马神经元生长增殖活力、凋亡、Caspase-3活件等指标.结果显示缺氧可抑制SD大鼠海马神经元的生长增殖活力,并伴随着神经元凋亡和Caspase-3活件增高,且随着缺氧时间的增长程度加重.以上结果说明,缺氧通过诱导细胞凋亡导致SD大鼠海马神经元的损害,Caspase-3活性的激活可能是其重要的通路之一.
关键词： 海马神经元 凋亡 caspase-3活性 缺氧 -
培养海马神经元突触外NMDA受体通道电流在发育中的变化
为观察培养大鼠海马神经元突触外NMDA受体通道电流在发育中的变化,本研究采用膜外面向外模式记录突触外NMDA受体介导的单通道电流.结果显示:培养2周神经元的电流幅度和开放概率比培养1周神经元大,但电导和翻转电位无显著差异.培养2周神经元只出现高电导开放,培养1周神经元同时出现高电导和低电导两种开放形式.NR2B受体亚型的特异性拮抗剂ifenprodil可降低培养1周和2周海马神经元的电流幅度、电导和开放概率,且对培养2周神经元开放概率的抑制作用更明显.以上结果表明,培养海马神经元突触外NMDA受体通道电流有发育变化,且培养1周神经元突触外NMDA受体的NR2亚型可能为NR2B和NR2D;而神经元培养到2周时,突触外主要为NR2B亚型,且数量有所增加.
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银杏叶提取物神经保护作用中Snk-SPAR途径机制探讨
为观察银杏叶提取物EGb761的神经保护作用与突触活化过程中Snk (serum-induced kinase)-SPAR (spine-associated Rap guanosine triphosphatase (GTPase) activating protein)途径之间的相关性,本研究采用RT-PCR、蛋白质免疫印迹及免疫荧光双重标记方法观察了EGb761对谷氨酸刺激后诱导的体外培养海马神经元中Snk、SPAR表达水平及分布变化的影响.结果表明,无论在mRNA水平还是蛋白质水平,EGb761均能明显阻断突触活化后Snk-SPAR途径的激活,并对谷氨酸刺激后神经元突起上Snk分布增多及其所导致的SPAR分布减少有明显的干预作用.以上结果说明,对树突棘内结构蛋白的调节以及对树突棘结构的稳定作用是EGb761神经保护作用的一个重要靶点.
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人参皂苷Rg2对体外培养的海马缺氧神经元的预防保护作用
为观察人参皂苷Rg2对缺氧大鼠海马神经元的保护作用,选取Wistar大鼠海马神经元体外培养14 d,随机分为对照组、5μmol/L尼莫地平组(尼莫地平组)、Rg2 0.025 mmol/L组(Rg21组)、Rg2 0.050 mmol/L组(Rg22组).将相应药物加入到培养液中孵育4 h后,建立急性缺氧细胞模型.采用流式细胞仪检测各组神经元缺氧后的细胞凋亡情况,用酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)的含量,并对所得结果加以比较.结果发现,离体条件下人参皂苷Rg2可显著增强海马神经元的活性,降低其凋亡率及死亡率;提高细胞上清液中超氧化物歧化酶的活性,降低MDA及NO的含量,且呈量效比例关系.以上结果提示,人参皂苷Rg2在体外有抗缺氧损伤的作用.其作用机制可能是通过抑制细胞凋亡、提高抗氧化酶的活力、清除自由基而发挥作用.
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神经生长因子对Aβ1-40诱导海马神经元周期蛋白异常表达的影响
为了探讨神经生长因子(NGF)对β-淀粉样蛋白诱导海马神经元周期蛋白表达的影响.本研究取新生3 d内大鼠海马细胞行体外培养7 d,分别在加入Aβ1-40前后加入NGF和等体积培养液,采用β-tubulin、ChAT免疫组化、cyclin免疫荧光进行检测.β-tubulin免疫组化证实所培养的为特异性结构完整的海马神经元;cyclin免疫荧光检测、ChAT免疫组化显示Aβ1-40导致cyclin A、cyclin B1水平显著增高及ChAT免疫阳性细胞明显减少;而给予NGF可在不同程度上降低cyclin A、cyclin B1蛋白水平,增加ChAT免疫阳性细胞.结果提示,NGF能有效地阻止和轻度地修复Aβ1-40诱导的海马细胞损伤,对Aβ引起的海马神经元内异常表达细胞周期蛋白有一定的抑制作用.
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低氧预处理对大鼠海马神经元缺氧耐受性和bcl-2表达的影响
采用免疫组织化学方法观察了低氧预处理对大鼠海马神经元缺氧耐受性和bcl-2表达的影响.结果显示,经低氧预处理的海马神经元缺氧-复氧后bcl-2表达较对照组明显增强,神经元损伤程度减轻,神经元存活数明显高于对照组.本结果表明,低氧预处理可使海马培养神经元对缺氧产生耐受,增加缺氧-复氧后神经元bcl-2的表达.提高神经元存活数.
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低氧预适应可减少缺氧--复氧后大鼠海马培养神经元凋亡
用原位末端标记(TUNEL)法观察低氧预适应对大鼠海马培养神经元缺氧缺氧-复氧后神经元凋亡的影响.结果显示,经低氧预适应的海马神经元缺氧-复氧后凋亡神经元百分率明显低于对照组.本结果表明.低氧预适应可使体外培养的海马神经元对缺氧产生耐受,减少缺氧-复氧后的海马神经元凋亡.
