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小鼠甲胎蛋白基因的克隆真核表达载体构建及表达鉴定
目的:克隆小鼠甲胎蛋白(AFP)基因,构建小鼠AFP真核表达载体并进行表达鉴定.方法:从Hepal-6细胞中提取总RNA进行RT-PCR,克隆出小鼠AFP基因,亚克隆于pcDNA3.1载体,重组阳性克隆进行酶切和测序鉴定.重组质粒瞬时转染CHO-K1细胞,Western blot检测小鼠AFP的表达.结果:利用RT-PCR从Hepal-6细胞总RNA中成功克隆出1.8kb的小鼠AFP基因,重组阳性克隆经酶切和测序鉴定证实目的基因已正确插入pcDNA3.1载体中,Western blot结果证实重组质粒pmAFP能够在CHO-K1细胞中正确表达.结论:小鼠AFP真核表达载体构建成功,为进一步研究其在肝癌免疫治疗中的作用奠定了基础.
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pBV220-HPV16L1和pBV220-HSVgD蛋白的表达鉴定与宫颈癌预防的研究
自1977年Laverty在电镜中观察到宫颈癌活检组织中存在人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)颗粒之后,学者们对HPV与宫颈癌之间的关系进行了研究,认为HPV是导致富颈癌发生的主要因素[1].研究也证实,高危型HPV16也是我国妇女宫颈癌的主要型别[2].
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MicroRNA-125a质粒表达载体的构建及其表达活性
背景:pSuper是一种非编码RNA的真核表达载体,可在细胞质内表达miRNA前体,经过细胞自身的Dicer酶切后形成miRNA成熟体,其过程能够完全模仿细胞内源性miRNA形成过程.因此,利用pSuper表达载体构建一种肝癌抑制性miRNA:miR-125a的表达载体,为下一步研究其抗癌机制奠定了基础.目的:构建miR-125a的真核表达质粒pSuper-miR-125a,并验证其表达miR-125a的效率和特异性.方法:PCR扩增miR-125a前体(Pre-miR-125a)的目的片段,将其T-A克隆入pMD18-T过渡质粒载体,限制性内切酶切下目的片段,连接入pSuper质粒表达载体得到pSuper-miR-125a重组质粒;将重组质粒转染Hela细胞,miRNA定量PCR检测重组质粒表达miR-125a的效率和特异性.结果与结论:成功将miR-125a前体(Pre-miR-125a)片段克隆入真核表达质粒pSuper H1启动子下游,获得pSuper-miR-125a重组表达质粒,转染该质粒进入Hela细胞后能够在细胞内高效和特异的表达miR-125a,进一步证明 pSuper真核表达质粒适合miRNA的表达研究.
关键词： 表达载体 MicroRNA-125a 表达鉴定 pSuper 质粒 -
广西巴马小型猪α-1,3半乳糖转移酶基因真核表达载体的构建及鉴定
目的 通过RT-PCR扩增巴马小型猪GGTA1基因,分析其序列的结构特点并构建真核表达载体,为生产GGTA1基因沉默的广西巴马小型猪奠定基础.方法 根据NCBI上发布的猪α-1,3半乳糖转移酶基因cDNA序列(AF221508),设计合成一对含有 HindⅢ和BamHI酶切位点的特异性引物,以广西巴马小型猪肝脏组织总 RNA为模板进行RT-PCR,所得目的片段经纯化、克隆、鉴定和测序;将目的基因与pEGFP-N 1进行双酶切后连接构建真核表达载体pEGFP-GGTA1,通过测序,双酶切鉴定.结果 所克隆的广西巴马小型猪GGTA1基因存在缺失第五外显子(81-116) 的GGTA1序列,序列全长1 080 bp和未缺失第五外显子的GGTA1序列,全序列为1 116 bp.构建两个表达载体(缺失第五外显子 pEGFP-GGTA1-1、未缺失第五外显子pEGFP-GGTA1-2).结论 广西巴马小型猪GGTA1基因存在第五外显子缺失的现象,通过对GGTA1基因克隆序列进行分析以及构建两个真核表达载体,为后面在猪源PK-15细胞中对其进行表达鉴定以及巴马小型猪 α-1,3半乳糖转移酶基因的沉默实验奠定基础.
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NME1重组腺病毒构建及表达鉴定
目的：应用 AdEasyTM 腺病毒载体系统构建含人 NME1基因的重组腺病毒,检测 NME1基因在肺癌细胞的表达。方法从人肝脏标本克隆带有 KpnⅠ,XhoⅠ双酶切位点的 NME1cDNA,利用细菌体内同源重组法将 NME1正向连接至腺病毒载体上,测序鉴定正确后,于 QBI-293A 细胞中包装扩增,TCID 50法检测重组腺病毒滴度,重组腺病毒转染至肺癌细胞 GLC-82,检测 NME1在细胞内表达。结果肝脏组织克隆出470bp 条带,测序与 NME1编码序列相符,测得重组腺病毒滴度为1010 TCID 50/ mL ,免疫实验显示 NME1在 GLC-82细胞成功表达。结论成功构建含人 NME1基因的重组腺病毒并转染肺癌细胞,检测到 NME1在肺癌细胞中正常表达。
关键词： NME1基因 AdeasyTM 载体系统 重组腺病毒 表达鉴定 -
稳定表达叶酸受体α的C26细胞株的建立
目的 建立稳定表达叶酸受体α(FRα)的C26细胞,用于FRα基因疫苗的后续研究.方法 采用脂质体转染法,将前期构建的重组真核表达质粒pcDNA3.1-FRα基因导入C26细胞,用G418加压进行筛选,并通过单克隆操作,建立稳定转染叶酸受体α基因的单克隆细胞株.利用反转录PCR及免疫荧光细胞化学染色检测稳定转染细胞中叶酸受体α基因的表达情况,并利用反转录PCR检测传代细胞中FRα基因表达的稳定性.结果 经转染、G418筛选以及单克隆化操作,得到单克隆FRα基因稳定转染细胞株,所得单克隆稳定转染细胞株可表达FRα mRNA及蛋白,并能够在多次传代后保持表达的稳定性.结论 成功构建了FRα稳定转染细胞株.
