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TLR4在HSP70EC-TCV冲激的DC成熟过程中的作用
观察TLR4在Hca-F榄香烯复合瘤苗来源的HSP70(HSP70EC-TCV)冲激处理的小鼠骨髓来源的DC成熟过程中的作用.用rmGM-CSF和rmIL-4诱导小鼠骨髓来源的DC,以HSP70EC-TCV或加入抗TLR4抗体30 min后再用HSP70EC-TCV冲激处理DC,流式细胞仪检测DC的CD40和CD86表达,ELISA法检测DC上清中IL-12和T细胞上清中IL-2浓度,MTT法检测T细胞对Hca-F细胞的杀伤率.结果表明,抗TLR4抗体对DC的CD40和CD86表达无明显影响,但对HSP70EC-TCV诱导DC分泌IL-12和进而致敏的T细胞分泌IL-2及产生杀瘤功能有明显的抑制作用.TLR4信号通路参与HSP70EC-TCV诱导DC成熟过程.
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榄香烯复合瘤苗的HSP70表达及其主动免疫预防效应
为进一步阐明本室专利榄香烯复合瘤苗(EC-TCV)的主动免疫效应与其HSP70-肿瘤肽之间的关系,本文以42℃热休克(H)为对照,首先检测了榄香烯(E)、丝裂霉素C(MMC)、戊二醛(G)单独或复合处理时对小鼠HCa-F肝癌、L615白血病细胞膜HSP(HSP70、HSP90)表达的影响,发现只有膜HSP70的表达在两种榄香烯复合瘤苗中均升高,随后以E-MMC复合处理的HCa-F细胞中提纯的HSP70-肿瘤肽(HHSP70)为免疫原,以小鼠HCa-F肝癌细胞为模型,研究了HHSP70的主动免疫预防效应及其特异性.结果表明,E、MMC、G同H相似,也具有应激原作用,能诱导应激蛋白HSP70的表达;而且HSP70在HCa-F和L615两种肿瘤细胞均以E-MMC-G三者复合处理时为高;HHSP70能诱发机体产生主动抗瘤效应,且这种效应有一定的肿瘤特异性.
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P53和Hsp70在肝癌、肝硬化及肝血管瘤的表达及意义
目的 探讨P53和Hsp70在肝癌、肝硬化及肝血管瘤表达的差异性及其意义.方法 选取2003年6月至2016年12月在我院确诊的肝癌(80例)、肝硬化(30例)、肝血管瘤(30例)组织切片进行免疫组织化学染色,并进行统计学分析.结果 P53在肝癌组中的表达水平高于肝硬化组、肝血管瘤组,差异均有统计学意义(P＜0.001).Hsp70在肝癌组中的表达水平明显高于肝硬化组(P=0.003).P53的肝癌诊断灵敏度为50.9％,特异度为78.2％;Hsp70的肝癌诊断灵敏度为98.9％,特异度为77.8％.两指标结合的并联灵敏度和特异度分别为95.5％和85.5％,串联灵敏度和特异度分别为33.6％和98.9％.肝癌按分化程度不同分为低分化组,中分化组和高分化组.P53表达水平在低分化组高于中分化组(P＜0.05),同时中分化组又高于高分化组(P＜0.05);Hsp70在低分化组和中分化组的表达水平高于高分化组(P＜0.05),但低分化组和中分化组的Hsp70表达差异无明显统计学意义(P＞0.05).结论 P53和Hsp70对肝癌的诊断具有重要的临床和病理意义,两者适当的联合运用可以显著提高诊断的准确度.
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热应激诱导的HSP70在肝脏缺血再灌注损伤中的作用
热休克蛋白(HSP)是70年代由美国学者Tissieres等发现的一类蛋白质家族,现证明HSPs广泛存在于各种原核和真核细胞中.在正常生长条件下,各种细胞中HSPs占细胞总蛋白含量的5%～10%,当细胞处于高温及其他应激条件,HSP表达明显增高.
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43℃热处理对体外培养的猴支持细胞中热休克蛋白105,70和60表达的影响
目的:研究热处理对原代培养的猴支持细胞中热休克蛋白(Hsps)105、70和60表达的影响,并分析可能的信号通路.方法:分离青春期恒河猴睾丸的支持细胞,以Western blot、实时定量PCR和免疫荧光化学法分析43℃热处理对三个热休克蛋白mRNA和蛋白表达的影响.结果:Hoechst 33342染核实验表明热处理后支持细胞并未发生凋亡.Hsp105在未处理的支持细胞有基础表达,热处理后12h其mRNA和蛋白水平升高了约20倍.未处理的支持细胞不表达Hsp70,但热处理显著诱导了它在胞浆中的表达.Hsp70表达的变化时相与Hsp105相似.与Hsp105和Hsp70相比,Hsp60在热处理后的变化要小得多,43℃处理后12h-48h,其蛋白水平仅为对照的1.5倍左右.胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase,ERK)1/2的抑制剂U0126或磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide kinase-3,PI3K)抑制剂LY294002可部分阻断热处理对Hsp105和Hsp70的诱导作用.结论:这些结果表明ERK和/或PI3K信号通路可能介导热诱导的猴支持细胞热休克蛋白的表达,但这三种热休克蛋白的表达模式并不相同.该结果提示它们在支持细胞中可能有不同的调节功能.
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Snail mRNA与HSP70mRNA在宫颈鳞癌中的表达及其与生物学特征的关系
背景与目的:Snail和热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)可能参与多种恶性肿瘤的侵袭转移,但关于两者与宫颈癌的关系报道较少.本研究探讨Snail,HSP70 mRNA在宫颈癌变过程中的表达及其与生物学特征的关系.方法:应用原位分子杂交方法,检测Snail,HSP70 mRNA在70例宫颈鳞癌、35例宫颈鳞状上皮内瘤变和15例宫颈慢性炎症组织中的表达.结果:(1)70例宫颈鳞状细胞癌组织中,Snail、HSP70mRNA阳性率分别为80.0%(56/70)、85.7%(60/70),分别高于宫颈鳞状上皮瘤变组织的60.0%(21/35)、45.7%(16/35)和宫颈慢性炎症组织的20.0%(3八5)、26.7%(4八5),差异均有统计学意义(P<0.05).(2)Snai1、HSP70 mRNA的表达在淋巴结转移组为95.8%(23/24)、91.7%(22/24),明显高于无转移组的71.7%(33/46)、82.6%(38/46)、Snail mRNA表达与淋巴结转移有关(P<0.05),而HSP70 mRNA的表达与淋巴结转移无关(P>O.05);Snail mRNA与HSP70 mRNA的表达呈正相关(r=0.306,P
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硫化砷对K562/ADM细胞HSP70蛋白表达的影响
目的:探讨硫化砷(As2 S2)对K562及其耐药细胞株K562/ADM细胞膜HSP70蛋白表达的影响.方法:采用流式细胞仪(FCM)测定K562和耐药细胞K562/ADM细胞膜HSP70蛋白表达及细胞凋亡,利用RT-PCR方法检测HSP70的mRNA水平.结果:硫化砷能增加细胞膜HSP70蛋白表达,且与时间及浓度成正相关,而在mRNA水平上仍有较高的表达.K562/ADM细胞膜HSP70蛋白表达和细胞凋亡率均高于K562细胞.结论:硫化砷能增加细胞膜HSP70蛋白表达,且这种改变可能对细胞凋亡率产生一定影响.
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融合穿膜肽的HSP70基因联合CIK细胞对裸鼠胃癌移植瘤的治疗效果
目的:观察融合穿膜肽的HSP70基因联合CIK细胞对裸鼠胃癌移植瘤的治疗效应.方法:采用编码11个精氨酸(11R)的穿膜肽序列融合HSP70基因序列,构建重组腺病毒载体AdCMV-HSP70s、AdCMV-HSP70(无穿膜肽对照)和AdCMV-EGFV(空载体对照).Western blotting、ELISA法检测重组腺病毒介导的HSP70基因在胃癌SCG-7901细胞中的表达,MTT检测重组腺病毒感染后HSP70分泌性表达对胃癌细胞的抑制作用.裸鼠移植瘤模型的抗瘤实验检测HSP70基因联合CIK细胞对胃癌移植瘤的抗瘤效应.结果:与AdCMV-HSP70感染细胞比,AdCMV-HSP70s感染细胞的HSP70表达量明显增加[胃癌SGC-7901细胞:(360.72±20.89) vs(121.01±15.94) ng/ml,P＜0.05;胃黏膜上皮GES-1细胞:(188.62±10.82) vs(135.00 ±13.96) ng/ml,P＜0.05].融合11R的HSP70蛋白能够穿膜并分泌到细胞外后对胃癌细胞产生一定的增殖抑制作用[MOI=100 pfu/cell时,细胞存活率(66.33±4.33)％vs(101.33±7.64)％,P＜0.01].AdCMV-HSP70s+ CIK联合治疗对胃癌移植瘤的抑制率显著高于AdCMV-HSP70+ CIK组[(66.5±7.3)％vs(43.6±5.6)％,P＜0.05],该组移植瘤组织间质中CD3+T细胞浸润数量也明显多于后者.结论:融合穿膜肽可明显促进HSP70蛋白的表达和分泌,和CIK细胞联合治疗能增强抗瘤免疫效应,从而显著抑制裸鼠胃癌移植瘤.
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Hsp70-肿瘤抗原肽复合物防治小鼠黑色素瘤B16肺转移的作用
目的:探讨热休克蛋白70-肿瘤抗原肽复合物(Hsp70-antigen peptide complexes)对小鼠黑色素瘤B16转移的防治作用.方法:分别从小鼠腿部接种的B16实体瘤及小鼠肺B16转移灶提取混合抗原肽,体外与Hsp70结合制得复合物,此复合物免疫小鼠后用于预防或治疗经尾静脉接种转移至肺的B16黑色素瘤,观察其对肿瘤转移的防治作用.结果:Hsp70-肿瘤抗原肽复合物免疫后肺转移灶节结数显著减少(P＜0.01),体外脾细胞表现出对B16较高的杀伤率(P＜0.01);并对肺转移灶有显著的治疗作用(P＜0.01),而从B16实体瘤提取的混合抗原肽制得的复合物比从肺转移灶提取的混合抗原肽制得复合物有更好的治疗效果(P＜0.01),表现出体外脾细胞对B16更高的杀伤率(0.01＜P＜0.05).结论:Hsp70-肿瘤抗原肽复合物对肿瘤的转移有明显的防治作用,而从实体瘤提取的混合抗原肽比从转移灶提取的混合抗原肽更为有效.
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榄香烯处理增加肿瘤细胞膜HSP70表达机制的研究
热休克蛋白(heat shock protein,HSP)是指热应激(或其它应激)时细胞新合成或合成增加的一组蛋白质,它们是细胞内的主要分子伴侣,在细胞的结构维持、更新、修复及免疫等方面发挥重要作用[1].榄香烯复合瘤苗是用中药温莪术抗癌有效成分榄香烯等处理肿瘤细胞制备的,能够诱导比较强的抗瘤主动免疫效应.
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吐温80合并温热诱导BGC-823细胞的抑制作用及对凋亡相关因子的影响
目的观察膜活化剂吐温80合并温热作用对人胃癌细胞BGC-823的抑制效应及其对Hsp70、bcl-2、bax表达的影响.方法通过MTT法,测定0.1%及0.15%吐温80与42℃温热合并作用对BGC-823细胞的抑制作用;运用免疫细胞化学染色,观察0.1%吐温80与42℃温热合并作用后(0h、8h、16h、24h)BGC-823细胞Hsp70、bcl-2、bax表达的改变.结果吐温80合并42℃100min温热作用对BGC-823细胞具有明显的抑制效应,温热后保留吐温80继续作用将进一步增强抑制效应,合并抑制效应与吐温80浓度相关(P＜0.01).合并作用能明显抑制BGC-823细胞热作用后的Hsp70表达,但bcl-2、bax的表达均增加,且bax的表达强于bcl-2,并全部分布于胞浆.结论吐温80与42℃温热有明显协同抑制肿瘤细胞生长效应,对Hsp70和bcl-2、bax表达及分布的影响提示其抑制机理可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关.
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胰岛素对局灶性脑缺血再灌注大鼠HSP70表达的影响
目的:探讨胰岛素对脑缺血再灌注损伤的中枢保护机制.方法:参照ZeaLonga线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,采用免疫组化法检测同一剂量胰岛素(2IU@kg-1)对缺血再灌注不同时限点脑组织HSP70蛋白的表达情况.结果:与对照组相比,胰岛素能显著上调缺血侧大脑皮质及基底节区HSP70蛋白的表达(x2检验,P＜0.001),表达高峰主要在再灌注后24 h.结论:胰岛素能上调缺血再灌注脑组织HSP70蛋白的表达,这可能是其发挥中枢保护作用的机制之一.
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电刺激小脑顶核后感觉皮质及基底节HSP70表达变化的研究
为探讨电刺激小脑顶核(Fastial nucleus,FN)预置性神经保护作用的机制,观察电刺激FN后感觉皮质及基底节HSP70表达的变化.建立大鼠电刺激小脑顶核模型,分别在电刺激后即刻(0 h),l,3,7,10 d,取感觉皮质及基底节所在脑组织,冷冻切片,进行HSP70免疫组化染色,图像分析测定平均光密度值.并设立假刺激组及小脑齿状核(Dentate nucleus,DN)刺激组作为对照.一侧电刺激FN后即刻,对侧感觉皮质及基底节HSP70表达无明显变化(P>0.05),而1 d后HSP70表达显著增高(P<0.01);3 d后,其表达有所降低,但仍高于假刺激组(P<0.05),7 d后其表达水平降至基础水平.同侧感觉皮质及基底节在电刺激FN后1 d,HSP70表达也有显著增高(P<0.05),但其增高水平明显低于右侧,3 d后其表达降至基础水平.假刺激组及DN刺激后1 d,HSP70表达无明显改变.结果提示电刺激FN诱导皮质及基底节HSP70表达的增高,可能与其预置性神经保护作用有关.
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CO2激光对豚鼠耳蜗Hsp70和诱生型一氧化氮合酶表达特点的研究
目的 探讨CO2激光照射豚鼠耳蜗后Hsp70(heat shock proteins 70)和诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthetase,iNOS)表达的改变及与耳蜗听觉功能变化的关系.方法 红目豚鼠36只,随机分为3组(A,B和C组),分别以功率为1,2,3 W的CO2激光在豚鼠左耳耳蜗底周打孔,此为实验耳,右耳为对照耳.于术前1 d及处死前检测听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR).术后即刻和术后3周分批断头处死豚鼠,以链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物免疫组织化学法及图像分析技术观察激光照射后耳蜗Hsp70和iNOS的表达情况.结果 术后即刻3组ABR反应阈值较术前明显升高(P均＜0.05),照射后3周A组ABR反应阈值基本恢复(P＞0.05),B,C组有所下降,但仍高于术前(P均＜0.05);术后即刻3组耳蜗中Corti器和螺旋神经节Hsp70和iNOS表达较对照组明显增强(P均＜0.01),术后3周A组Hsp70和iNOS表达与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),B,C组两者表达较对照组有所增强(P均＜0.05).A组和B组术后即刻和术后3周、C组术后即刻ABR阈值的变化和Hsp70和iNOS阳性反应平均灰度值的变化呈负相关(P均＜0.05),而C组术后3周三者变化无相关性(P＞0.05).结论 CO2激光照射豚鼠耳蜗后Hsp70和iNOS表达增强,其表达程度与听觉功能改变密切相关.
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异菝葜皂苷元对H2O2氧化损伤SH-SY5Y细胞的保护作用及其分子机制
目的 观察异菝葜皂苷元(SMI)对氧化应激损伤人神经母细胞瘤株(SH-SY5Y)细胞的保护作用,并初步探讨其分子机制.方法 将SH-SY5Y细胞用不同浓度(0.01、0.1、1μmol/L) SMI或等体积DMSO预处理24 h,然后加入600 μmol/L过氧化氢(H2O2)处理.显微镜下观察SH-SY5Y细胞形态学变化,噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,流式细胞仪检测胞内活性氧(ROS)水平,Western blotting检测p-Akt/Akt和HSP70的表达,并检测PI3K抑制剂LY294002对HSP70表达的影响.结果 SMI预处理浓度依赖地改善H2O2损伤SH-SY5Y细胞的形态,提高损伤细胞存活率,其中0.1、1μmol/L SMI预处理细胞存活率显著升高(P ＜0.05,P＜ 0.001).1μmol/L SMI显著抑制H2O2诱导的ROS升高(P＜0.05).H2O2诱导p-Akt/Akt和HSP70表达,但SMI预处理进一步提高p-Akt/Akt和HSP70表达水平(P＜0.01,P＜0.05),且PI3K抑制剂能阻断HSP70表达的升高(P＜0.001).结论 SMI对H2O2诱导的氧化应激损伤SH-SY5Y细胞具有明显的保护作用,其作用机制可能与降低胞内ROS水平及高度激活PI3 K/Akt/HSP70信号通路有关.
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点突变对HSP70蛋白自身磷酸化和ATP反应的影响
目的通过比较HSP70野生型和突变型蛋白的自身磷酸化及ATP分解合成反应的不同,探讨HSP70的作用机制.方法运用基因定位诱导突变技术,将89和227位组氨酸分别替代以丝氨酸(H89S,H227S),分析野生型和突变型HSP70蛋白的自身磷酸化过程,对两种蛋白的ATP分解和合成变化进行研究.结果突变的H89S蛋白自身磷酸化、ATP分解和合成受到抑制,有剂量反应关系存在;野生型和H227S蛋白的ATP交换过程未受到影响.结论89位组氨酸点突变能显著降低ATP酶交换反应,但它的自身磷酸化可能并非必须的介导位点或只是一个选择性的功能侧链.
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HSP27和HSP70在老年性白内障和透明晶状体中的表达
目的 观察热休克蛋白HSP27和HSP70在老年性白内障和透明晶状体中的表达情况.方法 Western Blot法测定HSP27和HSP70在老年性白内障和透明晶状体中的表达情况.结果老年性白内障的晶状体和透明晶状体中均有HSP27和HSP70的表达.经t检验,老年性白内障晶状体中HSP27(1.08±0.33)的表达与正常对照组(0.61±0.13)相比,差异存在统计学意义(P<0.05),老年性白内障晶状体中HSP70(1.41±0.48)的表达与正常对照组(0.67±0.12)相比,差异亦存在统计学意义(P<0.05).结论 老年性白内障晶状体中HSP27和HSP70的表达高于透明晶状体.
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人HSP 70真核载体的构建及其在胆囊癌细胞中的表达
目的 构建真核表达载体pcDNA 3.0-Hsp70,并在胆囊癌细胞SGC996中进行表达.方法 构建真核表达载体pcDNA 3.0-Hsp 70,经EcoR Ⅰ及BamH Ⅰ双酶切鉴定并测序;通过脂质体法转染SGC 996胆囊癌细胞,经G418抗性筛选获得稳定表达细胞株;用流式细胞术检测其表达情况.结果 酶切电泳和DNA测序证实载体构建正确;体外转染入SGC 996细胞中后,可见转染细胞有Hsp 70蛋白的表达.结论 成功构建了pcDNA 3.0-Hsp70真核表达载体,为研究Hsp70在肿瘤免治疗中的作用奠定了基础.
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温热对BGC-823细胞抑制作用及Hsp70、Bcl-2、Bax表达的影响
目的观测温热对人胃癌细胞BGC-823的抑制作用及Hsp70、Bcl-2、Bax表达的影响.方法通过MTT法,测定41℃100min、42℃100min对BGC-823细胞的抑制作用;运用免疫组化ABC法染色,观察42℃100min作用后0、8、16、32h,BGC-823细胞Hsp70、Bcl-2、Bax的表达.结果(1)BGC-823细胞在41℃及42℃温热作用后,均受到一定抑制;42℃温热比41℃对细胞的抑制作用较强且持久(P<0.01);(2)42℃温热作用后细胞Hsp70、Bcl-2表达均明显增加,16h表达达到高峰,且主要分布于核区;Bax表达也增加,但低于Bcl-2.结论温热对BGC-823细胞有一定抑制作用,Hsp70、Bcl-2表达增加可能与细胞自身修复或自身保护有关,Bcl-2的胞核分布可能与温热对细胞的抑制有关.
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脑淋巴引流阻滞加重蛛网膜下腔出血后脑脊液所致海马神经元凋亡
本文旨在探讨脑淋巴引流系统在蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后神经元损伤中的作用.分别建立兔SAH、SAH+脑淋巴引流阻滞(cerebral lymphatic blockage,CLB)模型,于SAH模型建立后5 d抽取脑脊液,加入培养的大鼠海马神经元中,随机将神经元分为空白对照组、正常脑脊液组、SAH组、SAH+CLB组,分别于培养0.5 h、1 h、2 h、4 h后,检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率,流式细胞术检测神经元凋亡,免疫组织化学法检测细胞凋亡蛋白Bax、Hsp70的表达.结果显示:正常脑脊液对神经元LDH漏出率无影响,SAH组和SAH+CLB组脑脊液使神经元LDH漏出率增加,以SAH+CLB组更为显著;正常脑脊液没有引起神经元凋亡,SAH组出现神经元凋亡,SAH+CLB组神经元凋亡更为严重.在SAH组和SAH+CLB组均检测到Bax及Hsp70蛋白表达;Bax蛋白表达在SAH+CLB组大于SAH组,且呈时间依赖性增强;在0.5 h和1 h,SAH+CLB组Hsp70蛋白表达高于SAH组,而在2h和4h则表达减弱,SAH+CLB组表达高峰(1 h)早于SAH组(2 h).以上结果表明,CLB加重SAH脑脊液对神经元的损伤,提示脑淋巴引流系统在SAH后可能起到一定的内源性保护作用.
