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处理牙本质浸提液对牙髓细胞分化方面作用的研究
目的 观察人处理牙本质基质(human treated dentin matrix,hTDM)浸提液对人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)成牙和成神经方向分化的影响,为有效利用细胞外基质分子参与牙髓牙本质复合体的修复提供新线索.方法 体外分离培养hDPCs,免疫荧光及流式细胞术鉴定细胞组织来源;成脂、成骨及成神经诱导培养基诱导培养hDPCs,鉴定细胞多向分化能力.制备hTDM浸提液,诱导培养hDPCs7d后,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析细胞成牙和成神经方向分化的基因的改变.结果 qRT-PCR结果显示被诱导后hDPCs不同程度的增强表达ALP、OPN、OCN、BSP、DMP-1、DSP、β-Ⅲtubulin.结论 浸提的方法能够有效收集牙本质基质中的细胞外基质分子;浸提液能提供良好的诱导微环境诱导hDPCs成牙和成神经方向分化,这有利于牙髓牙本质复合体的修复.
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Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养人牙髓细胞
目的建立利用Ⅰ型胶原酶消化组织块体外培养人牙髓细胞方法.方法通过组织块Ⅰ型胶原酶消化法进行人牙髓细胞体外培养,免疫细胞化学法鉴定细胞组织来源,进行细胞传代,酶组织化学法对体外复层生长的人牙髓细胞爬片进行碱性磷酸酶组织化学染色,并检测其矿化能力.结果采用Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养的原代牙髓细胞,在第15～20 d出现汇合,第4～6代牙髓细胞在连续培养后具有复层生长特性,并具有显著的碱性磷酸酶活性,阳性染色强弱部位呈区域性分布,连续培养的牙髓细胞可形成矿化结节.结论Ⅰ型胶原酶消化组织块法可以很好地进行人牙髓细胞体外培养,可以用酶组织化学法研究牙髓细胞的生物学特性.
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体外组织培养模式的构建及转化生长因子促进牙髓细胞向成牙本质细胞诱导分化的研究
目的 通过构建体外组织培养模式,观察牙髓细胞向成牙本质细胞诱导分化的潜力及转化生长因子-β1(TGF-β1)的促进作用.方法 获取人第三磨牙牙髓组织,剪碎后与牙本质陶瓷粉(CDP)及2 μg/mL TGF-β1 混合,将混合物以骨基质明胶(BMG)为载体构建牙髓组织培养模型,在培养3、7、14和21 d后,通过HE和组织特异性染色鉴定有无骨-牙本质基质成分形成,免疫组化检测细胞有无牙本质特异性蛋白--牙本质涎蛋白(DSP)的表达.结果 牙髓组织经 TGF-β1诱导培养后可进一步矿化,甲苯胺蓝和Mallory染色表明在牙髓组织的中心出现骨一牙本质样基质的沉积,免疫组化检测牙髓细胞开始出现DSP的表达.结论 成功构建体外牙髓组织培养模型,该模型能维持牙髓细胞的生长和存活,可用于体外对牙髓细胞的诱导分化观察;该模型模式下 TGF-β1 可明显促进牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导潜能.
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低能量He-Ne激光致人牙髓细胞损伤对TGF-β和Bcl-2表达的影响
目的 探讨低能量He-Ne激光致人牙髓细胞损伤对转化生长因子β(TGF-β)和B-淋巴细胞白血病-2基因(Bcl-2)表达的影响.方法 4组牙髓细胞体外培养后,分别给予不同剂量的激光照射,A组为7.35 J/cm2,B组为14.70 J/cm2,C组为29.4 J/cm2,D组作为对照组,不行激光照射,照射时间均为15 min,共2次,每次间隔6h.在照射前(第0h)和照射后6、12h,分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测牙髓细胞相对活力,蛋白免疫印迹法测牙髓细胞TGF-β和Bcl-2的表达水平.结果 照射前,A、B、C组细胞相对活力均为100％;照射6、12h后,A、B组的相对活力均明显高于D组,而C组相对活力明显低于D组(P＜0.05).照射前,4组牙髓细胞中TGF-β和bcl-2的表达水平均无显著差异(P＞0.05);照射6、12h后,A、B组牙髓细胞中TGF-β和bcl-2的表达水平明显高于照射前,且高于D组,而C组牙髓细胞中TGF-β和bcl-2的表达水平明显低于照射前,且低于D组(P＜0.05).结论 适当剂量的低能量He-Ne激光照射,能够使牙髓细胞中TGF-β和Bcl-2的表达水平升高,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡.但如果照射剂量过大,则会使牙髓细胞中TGF-β和Bcl-2的表达水平降低.
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人牙髓细胞的三维培养及其白细胞介素1β的表达
目的 通过体外三维培养牙髓细胞,观察牙髓细胞形成细胞集落时炎症因子白细胞介素1β (IL-1β)的表达水平,探讨牙髓炎症发生的可能机制.方法 用U形底铺有琼脂糖的96孔板形成非黏附表面,每孔接种104个细胞形成三维培养体系.在细胞接种的0、24、48、72、96 h收集细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测体系中牙髓细胞IL-1β mRNA的表达水平,ELISA检测体系中牙髓细胞IL-1β蛋白的水平.结果 光镜下可见牙髓细胞接种20h后即可形成紧密的细胞聚集球体,培养至40h,细胞球体聚集更紧密.与培养0h的牙髓细胞相比,实时定量PCR检测发现三维培养24、48、72、96 h的牙髓细胞IL-1β mRNA表达水平明显增加,培养72、96 h牙髓细胞IL-1 β mRNA表达量高于培养24h的牙髓细胞;ELISA检测发现三维培养24、48、72、96 h的牙髓细胞较培养0h的细胞IL-1β蛋白水平明显增高,且培养72、96 h牙髓细胞IL-1β蛋白量高于培养24h的牙髓细胞.结论 三维培养牙髓细胞形成细胞集落能诱导牙髓细胞自发性表达和释放IL-1β.
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TGF-β1调控ERK/MAPK信号通路对人牙髓细胞增殖和分化能力的影响研究
目的:研究TGF-β1对牙髓细胞增殖、分化和ERK/MAPK信号通路的影响.方法:采用Western blot检测TGF-β1在急性牙髓组织、慢性牙髓组织和正常牙髓组织中的表达,然后采用Ⅰ型胶原酶消化分离培养牙髓细胞,不同浓度的TGF-β1处理牙髓细胞7d,CCK-8法检测细胞增殖.采用TGF-β1(5.0μg/L)和U0126(10μmol/L)分别单独或联合作用于牙髓细胞7d,CKK-8法检测细胞增殖;在第1、3、5和7天检测碱性磷酸化酶活性;第7天时Western blot检测ERK/MAPK信号通路中的关键蛋白PPAR-γ和ELK-1水平.结果:TGF-β1在牙髓炎组织中低表达,且TGF-β1浓度在0.1~5.0μg/L时,从作用第3天开始能够显著促进牙髓细胞的增殖(P<0.05),具有时间和剂量依赖效应.U0126能够抑制牙髓细胞的增殖和碱性磷酸化酶的活性,具有时间依赖性.TGF-β1能够促进PPAR-γ和ELK-1蛋白的表达,而U0126能够降低TGF-β1对PPAR-γ和ELK-1蛋白表达的促进作用.结论:TGF-β1可以促进牙髓细胞的增殖和分化,且具有时间和浓度依赖效应,其作用机制可能与ERK/MAPK信号通路相关.
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重组人细胞外基质磷酸化糖蛋白对人牙髓细胞体外矿化的影响
目的:探讨细胞外基质磷酸化糖蛋白(Matrix extracellular phosphoglycoprotein,MEPE)对人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPCs)在体外的矿化能力的影响,从而了解该蛋白在牙齿生长发育过程中的作用.方法:常规方法培养获得人牙髓细胞,实验组中使用的MEPEs的浓度为l00μg/L.通过Yonkossa染色观察MEPE对人牙髓细胞矿化的影响.结果:MEPE蛋白能促进人牙髓细胞的矿化.结论:MEPE具有促进人牙髓细胞的矿化的能力,可能在牙齿生长发育过程中起着重要的作用.
关键词： 牙髓细胞 矿化 细胞外基质磷酸化糖蛋白 -
大肠杆菌脂多糖影响Toll样受体4在人牙髓细胞的表达
目的:探讨大肠杆菌脂多糖(lippolysacchaide,LPS)对体外培养的人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPCs)Toll样受体4 (Toll-like receptor 4,TLR4)表达的影响及TLR4在LPS对牙髓细胞激活中的作用.方法:以大肠杆菌LPS刺激体外培养的人牙髓细胞,运用实时荧光定量RT-PCR和免疫荧光技术分别检测牙髓细胞TLR4 mRNA和蛋白的表达.利用抗体阻断和ELISA方法观察TLR4在LPS激活牙髓细胞释放IL-1β中的作用.结果:正常牙髓细胞不表达TLR4,1×10-4 g/L 大肠杆菌LPS作用HDPCs 6、12、24 h后均可见TLR4在胞膜/胞质的表达,胞核并不表达TLR4.FQ RT-PCR结果表明LPS能明显上调牙髓细胞TLR4 mRNA的表达(P＜0.001),并具有LPS浓度依赖性.抗体阻断和ELISA结果证实LPS能激活牙髓细胞释放IL-1β(P＜0.01),抗TLR4单抗能明显抑制LPS对HDPCs的激活(P＜0.05).结论:正常人牙髓细胞不表达TLR4,大肠杆菌LPS能诱导牙髓细胞表达TLR4 mRNA和蛋白.TLR4介导了LPS对牙髓细胞的活化,在LPS对牙髓细胞激活效应中具有重要作用.
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转化生长因子β1对人牙髓细胞微丝骨架的重组作用
目的:了解转化生长因子β1(TGF-β1)对人牙髓细胞微丝和微管骨架的作用.方法:I型胶原酶消化组织块法体外培养人牙髓细胞,以20 ng/ml的TGF-β1处理细胞,分别在第30 min、1、6和24 h收集细胞爬片,BODYPY- Phalloidin对微丝作直接荧光染色、Rhodamine RedTM对微管蛋白α(tubulin-α)作间接免疫荧光染色,采用激光扫描共聚焦显微镜观察TGF-β1作用于牙髓细胞后不同时间点微丝和微管的变化情况.结果:TGF-β1作用于人牙髓细胞后,微丝出现解聚重组现象,在30 min时间点,肌动蛋白(actin)在细胞膜下聚合成纤维形肌动蛋白F-actin,同时胞质内的F-actin解聚,6 h解聚明显,24 h后可见胞质内微丝重组.观察的各时间点,微管结构未见明显解聚重组现象.结论:TGF-β1能够使牙髓细胞微丝骨架重组.
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bFGF在氟中毒大鼠切牙牙髓中的表达和意义
目的:研究过量氟对大鼠牙髓细胞表达bFGF的影响.方法:选择20 只Wistar大鼠,随机分为2 组:I组(对照组)和II组(实验组).8 周后处死动物,利用磨片、HE染色、免疫组化染色技术观察过量氟对大鼠切牙形态及bFGF表达的影响.结果:实验组大鼠切牙釉质、牙本质生长线明显,牙本质可见钙质小球,牙髓细胞及髓腔内侧牙本质bFGF表达明显弱于对照组,差异有显著性(P<0.01).结论:过量氟可抑制牙髓细胞表达bFGF, 影响牙体硬组织的结构.
关键词： 氟 牙髓细胞 大鼠 碱性成纤维细胞生长因子 -
白细胞介素-1β诱导牙髓细胞的金属蛋白酶-1和COX2的表达
目的:探讨白细胞介素-1β对人牙髓细胞金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1,MMP-l)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX2)基因表达变化的生物学意义.方法:培养人牙髓细胞,传代至第4代,PTPCR检测人牙髓细胞是否表达IL-1β受体,进而用1 nmol/L人的重组IL-1β刺激人牙髓细胞18 h,提取细胞总RNA,反转录为cDNA,半定量PCR检测IL-1β对人牙髓细胞的金属蛋白酶-1、COX2的mRNA的表达变化.结果:人牙髓细胞表达IL-1β受体,而且用1 nmol/L人的重组IL-1β明显地刺激牙髓细胞的金属蛋白酶-1、COX2的mRNA表达.结论:牙髓炎时牙髓组织内的IL-1β生成增多,会进一步引发金属蛋白酶-1、COX2基因异常表达相应增多,而金属蛋白酶-1导致炎症基质降解、COX2将引发炎性痛的病理改变.
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dNCPs、TGF-β1及联合应用对人牙髓成纤维细胞增殖、ALP及矿化的影响
目的:观察牙本质非胶原蛋白(dentin non-collage proteins;dNCPs)、转化生长因子(trsnsforminggrowth factor;TGF-β1)及联合应用对人牙髓成纤维细胞生物学特性的影响.方法:利用混合酶消化法成功培养了人牙髓成纤维细胞,角蛋白及波形丝蛋白鉴定其来源.在细胞中分别加入牙本质粉、dNCPs、TGF-β1及其复合物,通过MTT、ALPase和Von-Kossa染色检测其作用.结果:dNCPs和TGF-β1可显著增加细胞的增殖及ALPase分泌,细胞可聚集成团形成矿化结节.结论:dNCPs和TGF-β1可改变人牙髓成纤维细胞的生物学活性,但两者间无相互促进作用.
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TGF-β1对人牙髓细胞内钙影响的激光共聚焦显微镜动态观察
目的:探讨TGF-β1信号转导过程与人牙髓细胞内钙[(Ca2 + )i]的关系.方法:体外培养人牙髓细胞经钙荧光指示剂Fluo-3负载后,用激光扫描共聚焦显微镜测定TGF-β1影响前后的人牙髓细胞内钙随时间变化情况.结果:TGF-β1(0.1 ng/L)使人牙髓细胞内钙先升高后降低,后维持在比加药前稍高的静息钙水平上.结论:通过TGF-β可引起牙髓细胞内Ca2+水平的显著变化,证明Ca2+参与了人牙髓细胞TGF-β1信号转导过程并参与将信号转入核内.
关键词： 转化生长因子β 牙髓细胞 激光扫描共聚焦显微镜 -
甲基丙烯酸β-羟乙酯对人牙髓细胞增殖和迁移的影响
目的：研究树脂单体甲基丙烯酸β-羟乙酯（HEMA）对人牙髓细胞（hDPCs）增殖和迁移的影响。方法：组织块法体外原代培养获得 hDPCs，以含不同浓度 HEMA 的 DMEM培养基与第3～5代 hDPCs 共同培养，用 MTT 实验检测 HEMA 作用于hDPCs 24、48、72 h 的增殖情况，Transwell 法观察细胞的迁移能力。结果：HEMA 在体外一定程度上抑制了 hDPCs 的增殖（与对照组比较，P ＜0．05），并呈时间浓度依赖性，24 h 组的细胞活力值均显著高于48 h 和72 h 组（P ＜0．05）。HEMA 减少了 hD-PCs 的迁移数（P ＜0．05）。结论：HEMA 体外能抑制人牙髓细胞的增殖和迁移。
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促红细胞生成素对人牙髓细胞增殖和成骨分化的影响
目的：探讨促红细胞生成素（EPO）对体外培养的人牙髓细胞（hDPCs）增殖和成骨分化的影响。方法：体外培养鉴定人牙髓细胞。使用 EPO 对在成骨诱导培养基中培养的牙髓细胞进行刺激，CCK-8检测 EPO 对牙髓细胞增殖的影响；20 U ／ml EPO 培养 hDPCs 7 d 和14 d，采用碱性磷酸酶活性（ALP）检测和茜素红染色观察 EPO 对牙髓细胞矿化的影响；利用 Real-time PCR 检测加入 EPO 后牙髓细胞成牙本质向分化相关基因的表达情况。结果：EPO 以时间和剂量依赖性方式促进牙髓细胞的增殖；20 U ／ml 的 EPO 后作用，牙髓细胞碱性磷酸酶活性显著提高（P ＜0．05），钙结节形成明显增多；成牙本质向分化相关基因 DSPP、OCN、OSTERIX、RUNX2的表达明显上调（P ＜0．05）。结论：EPO 能促进人牙髓细胞的增殖和分化。
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变形链球菌超声提取物对牙髓细胞增殖和天然免疫受体基因mRNA表达的影响
目的:观察变形链球菌超声提取物对牙髓细胞的增殖活性、天然免疫受体基因mRNA表达的影响.方法:采用组织块法原代培养牙髓细胞,通过不同浓度的变形链球菌超声提取物(1、10、100μg/ml)作用于牙髓细胞,MTT法检测牙髓细胞的增殖活性;荧光定量PER检测牙髓细胞NOD2、TLR2和TLR4 mRNA的表达水平.结果:1μg/ml变形链球菌超声提取物处理24 h可促进牙髓细胞的增殖;10μg/ml和100μg/ml处理24 h和48 h可明显抑制细胞增殖.变形链球菌超声提取物(10μg/ml)作用于牙髓细胞后,NOD2、TLR2和TLR4 mRNA表达量均增加.结论:变形链球菌超声提取物可抑制牙髓细胞的生长,促进NOD2、TLR2和TLR4 mRNA的表达.
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氟对小鼠牙髓细胞Ca2+浓度的影响
过量氟对牙齿损伤机制之一是氟影响Ca2+动态平衡.形态学研究表明,过量氟可以造成牙本质过度矿化和矿化不良.牙本质矿化过程中,成牙本质细胞需要转运大量的Ca2+,氟是否影响细胞Ca2+动态平衡还不清楚.本研究利用激光共聚焦显微镜技术(laser scanning confocal microscope,LSCM)观察过量氟对小鼠牙髓细胞内Ca2+浓度的影响.
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乏氧对人牙髓细胞增殖能力及碱性磷酸酶活性的影响
目的:探讨乏氧环境对人牙髓细胞(hDPCs)增殖能力及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase activity,ALP)活性的影响.方法:取第4代hDPCs分别在氧浓度为200mL/L(对照组)和10mL/L(乏氧组)的环境下进行培养;分别于培养后24 h 和48h,采用MTT法和PNPP法检测各组各时间点牙髓细胞的增殖能力及其ALP.结果:无论是乏氧组还是对照组,培养48h时的细胞增殖能力均明显高于其24h的增殖能力(P<0.05);而且同一时间点内乏氧组的增殖能力高于对照组(P<0.05).两组中培养48h的ALP活性均明显低于其培养24h(P<0.05);但同一时间点内乏氧组的ALP活性明显高于对照组(P<0.05).结论:乏氧环境能增强人牙髓细胞的增殖能力及碱性磷酸酶活性.
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聚乙烯醇对大鼠牙髓细胞矿化诱导能力的实验研究
目的:观察聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)对大鼠牙髓细胞的矿化诱导能力.方法:制备PVA涂层24孔板,分别以PVA、矿化诱导液对第4代SD大鼠牙髓细胞进行矿化诱导,通过定量的茜素红染色分析和碱性磷酸酶(ALP)活性检测比较二者的矿化诱导能力.结果:经PVA诱导的大鼠牙髓细胞,其ALP活性和茜素红分析在7d的培养过程中,显示明显持续增高的趋势(P<0.01).结论:PVA可诱导大鼠牙髓细胞矿化分化,有望成为组织工程化人工牙研究的支架材料.
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五倍子水提取物对内毒素诱导人牙髓细胞分泌IL-6的影响
目的:观察不同浓度五倍子水提取物对内毒素诱导人牙髓细胞分泌IL-6的影响.方法:采用组织块法体外培养人牙髓细胞,以含不同浓度五倍子水提取物(1.25、2.5、5.10、20 μg/mL)、25μg/mL内毒素和20mL/L新生牛血清的DMEM培养基作用于第5代人牙髓细胞,用放射免疫法测定IL-6含量,采用单因素方差分析(完全随机设计)和t检验对实验数据进行统计学分析.结果:低浓度(1.25、2.5、5、10、20μg/mL)五倍子水提取物能明显抑制25μg/mL内毒素诱导人牙髓细胞分泌IL-6,这种抑制作用在一定范围内呈浓度依赖性.结论:低浓度五倍子水提取物具有抑制内毒素诱导人牙髓细胞分泌IL一6的作用.
