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胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1在人牙髓细胞体外矿化过程中表达的实验研究
目的:研究胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1在人牙髓细胞体外矿化过程中的表达.方法:利用组织块法体外培养人牙髓细胞,实验组培养液中加入矿化诱导剂,对照组不加矿化诱导剂.培养14 d后,免疫细胞化学检测牙本质涎蛋白的表达;von kossa染色检测矿化结节的形成.培养期间,采用半定量RT-PCR技术监测LIM矿化蛋白1及碱性磷酸酶的表达,SPSS11.0软件分析结果.结果:培养14 d,实验组牙本质涎蛋白免疫细胞化学呈阳性表达,von kossa染色阳性,矿化结节形成;对照组牙本质涎蛋白表达阴性,von kossa染色阴性.RT-PCR结果显示碱性磷酸酶及LIM矿化蛋白1在实验组和对照组各时段均表达.培养期间,实验组LIM矿化蛋白1的表达显著性高于对照组,其中培养第2天及9天时表达分别达到两个高峰,约为对照组的1.8倍及3.0倍.培养期间,碱性磷酸酶的表达显著性增高,其中培养14 d时约为对照组的2.0倍.结论:首次发现LIM矿化蛋白1与人牙髓细胞的体外矿化过程相关,提示LIM矿化蛋白1可能在牙髓细胞的分化及矿化中发挥一定作用.
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双向电泳分析维生素D对牙髓细胞分化的影响
目的:用双向电泳分析牙髓细胞分化过程中产生或分泌的新蛋白质.方法:在体外培养牙髓细胞,给予一定时间的1,25-双羟维生素D3,促使牙髓细胞分化,结合双向电泳技术分析细胞分化前后蛋白质合成、分泌的变化.结果:pH4-8 和相对分子量MW 20～90 kD范围的蛋白斑点分布较多.双向电泳凝胶图像分析软件ImageMaster 2D Platium比较分析,给予维生素D孵育24 h后,检测到77个新的蛋白点,同时有17个蛋白点消失.结论:维生素D促使牙髓细胞分化,并产生或分泌了一些新的蛋白质,维生素D和这些蛋白质对牙齿的发育、矿化的过程起调节作用.
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脂多糖诱导牙髓细胞DNA双链断裂的研究
目的:探讨低剂量条件下脂多糖诱导牙髓细胞DNA损伤方法,为研究脂多糖诱导牙髓细胞DNA双链断裂及DNA修复提供实验模型.方法:10 μg/L脂多糖连续刺激牙髓细胞1、3、6次后,采取MTT及TUNEL分别检测其对牙髓细胞增殖及凋亡的作用;采用q-PCR及免疫印迹检测γ-H2A.X的mRNA及蛋白水平的表达;使用免疫荧光及免疫组化法观测γ-H2A.X在体内、外牙髓细胞的表达.结果:与对照组相比,10 μg/L脂多糖连续刺激对牙髓细胞增殖及凋亡均无显著性差异;脂多糖连续刺激6次后细胞免疫荧光显示在细胞核检测到γ-H2A.X的阳性表达,且蛋白及mRNA水平的表达较对照组有显著性增加(P＜0.05);免疫组化结果表明在脂多糖诱导4、6、8d后,γ-H2A.X在大鼠牙髓组织较对照组表达水平显著升高(P＜0.05).结论:低剂量脂多糖连续刺激可诱导牙髓细胞产生DNA双链断裂.
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高迁移率族蛋白B1对人牙髓细胞迁移能力和增殖效应的影响
目的:观察高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在人牙髓细胞(Human dental pulp cells,hDPCs)中的表达,以及对hDPCs增殖和迁移能力的影响.方法:采用组织块培养法,培养原代hDPCs,取第3～6代细胞用于实验.免疫荧光检测HMGB1在hDPCs中的表达及定位;分别用含不同质量浓度(0.1 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL)HMGB1的培养液培养hDPCs,5天后采用CCK-8法检测细胞增殖能力;细胞划痕实验法观察1 ng/mL质量浓度HMGB1对hDPCs迁移能力的影响.结果:HMGB1表达在hDPCs胞核;低浓度HMGB1(0.1 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL)明显促进细胞增殖;1 ng/mL HMGB1明显促进hDPCs迁移能力.结论:HMGB1表达在正常hDPCs胞核中,细胞外低浓度HMGB1可以促进细胞增殖和迁移.
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TGF-β1对人年轻恒牙牙髓细胞的增殖效应
目的:探讨转化生长因子(transforming growth factor ,TGFβ1)对培养人牙髓细胞的增殖效应.方法:应用MTT、3H-TdR渗入法观察TGFβ1对人牙髓细胞的增殖效应.结果:TGFβ1浓度在0.1 ng/ml～100 ng/ml时均可显著促进牙髓细胞的增殖,增殖效应呈现出浓度依赖性.结论:TGFβ1可能通过促进牙髓细胞的增殖参与牙本质-牙髓复合体的修复过程.
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Smad7反义寡核苷酸对TGF-β1调控人牙髓细胞生长和分化的影响
目的:观察Smad7反义寡核苷酸对转化生长因子β1(transforming growth factor-β, TGF-β1)调控人牙髓细胞生长和分化的影响.方法:细胞培养,细胞转染,MTT比色测定法和碱性磷酸酶活性测定法.结果:Smad7反义寡核苷酸促进TGF-β1对人牙髓细胞增殖的诱导作用和对碱性磷酸酶活性的抑制作用.结论:Smad7参与介导TGF-β1对人牙髓细胞增殖和ALP活性的调控,提示TGF-β1调控人牙髓细胞生长和分化可能是通过Smad信号途径发生的.
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大鼠牙髓细胞复合β-磷酸三钙多孔陶瓷体外培养的实验研究
目的:研究大鼠牙髓细胞与β-TCP复合培养后的生长情况及细胞活性,探讨β-TCP作为大鼠牙髓细胞支架材料的可行性. 方法:实验分两组,实验组为大鼠牙髓细胞与β-TCP复合培养,对照组为大鼠牙髓细胞常规培养.采用相差显微镜、电子显微镜观察细胞生长、贴附情况;采用MTT、细胞蛋白检测、碱性磷酸酶检测的方法评价大鼠牙髓细胞生长情况及细胞活性.结果:大鼠牙髓细胞复合β-TCP后生长良好,贴附于材料表面及孔隙内壁.MTT及细胞蛋白检测复合培养组和对照组无差异,6 d、9 d时复合β-TCP培养的大鼠牙髓细胞碱性磷酸酶活性明显高于对照组.结论:复合β-TCP进行培养的大鼠牙髓细胞生长良好,没有出现生长抑制现象,其细胞活性更明显增强,表明β-TCP完全符合牙髓细胞支架材料的要求,是一个具有很好应用前景的牙髓组织工程支架材料.
关键词： 牙髓细胞 组织工程 β-磷酸三钙多孔陶瓷 -
白细胞介素-1β介导牙髓细胞 MMP-1和COX-2的 mRNA表达的研究
目的:观察白细胞介素-1β对人牙髓细胞基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的mRNA表达的影响,探讨IL-1β介导MMP-1、COX-2 对炎症的基质降解、炎性疼痛产生机制的影响.方法:重组人IL-1β刺激牙髓细胞18 h,提取牙髓细胞总RNA,反转录为cDNA, 半定量PCR检测基质MMP-1、COX-2的mRNA的表达.结果:外源性的重组人IL-1β明显地刺激牙髓细胞MMP-1、COX-2的mRNA的表达,并呈一定浓度依赖性.结论:IL-1β使得牙髓细胞MMP-1、COX-2的mRNA的表达量增多,表明牙髓炎症时IL-1β分泌异常增多,会引发基质金属蛋白酶-1、环氧化酶-2(COX-2)表达异常的增多,参与并加剧炎性基质降解、炎性疼痛产生.
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骨碎补对体外培养人牙髓细胞增殖及超微结构的影响
目的:探讨骨碎补对体外培养的人牙髓细胞增殖及超微结构的影响.方法:组织块法体外培养人牙髓细胞.水提醇沉法提取骨碎补有效成分,以不同浓度骨碎提取液作用于体外培养的人牙髓细胞.MTT法检测骨碎补各浓度组对人牙髓细胞增殖的作用.扫描电镜和透射电镜下观察骨碎补对人牙髓细胞超微结构的影响.结果:原代培养的人牙髓细胞呈梭形或多角形.各浓度骨碎补均对体外培养的人牙髓细胞有促增殖作用,其中以100 mg·L-1质量浓度组促增殖作用明显.电镜下实验组人牙髓细胞表面枝状嵴丰富,细胞周围可见细胞外基质;细胞浆内有丰富粗面内质网和游离的核糖体,核内常染色质均匀分散,异染色质少.结论:骨碎补对体外培养的人牙髓细胞有明显的促增殖作用.
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牙髓细胞成牙本质向分化过程中DSPP基因的表观遗传学修饰
目的:通过检测牙髓细胞(DPC)体外成牙本质向分化过程中牙本质涎磷蛋白(DSPP)基因的表观遗传学修饰模式的变化.探讨表观遗传学机制在DPC成牙本质向分化中的作用.方法:在体外诱导DPC成牙本质向分化,采用Real-time PCR检测DSPP基因表达的改变,采用重亚硫酸盐测序法检测DSPP基因的甲基化水平改变,染色质免疫共沉淀检测DSPP启动子区组蛋白修饰(H3K27me3和H3K4me3)修饰的变化.结果:在DPC诱导分化后,DSPP的表达逐渐增高,伴随着基因启动区甲基化水平的降低,同时与转录激活相关的组蛋白修饰H3K4me3升高,而与转录抑制相关的组蛋白修饰H3K27me3降低.结论:DPC在成牙本质分化过程中DSPP表达的上调与DSPP启动子区域出现开放基因表达的表观遗传学修饰模式有关.这提示,表观遗传学调控参与到DPC成牙本质向分化的过程.
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人牙髓细胞向成牙本质细胞诱导分化中细胞周期变化
目的 建立成牙本质细胞样细胞体外培养体系,观察体外培养的牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中细胞周期的变化.方法 利用组织块酶解法培养人牙髓细胞并进行鉴定,使用矿化诱导液诱导其向成牙本质细胞样细胞分化.对细胞增殖情况使用流式细胞仪进行细胞周期测定.结果 ①获得的牙髓细胞均为波形丝蛋白阳性,角蛋白阴性,证明为中胚层来源的细胞.②诱导分化的牙髓细胞在2周左右进入复层生长期;3周左右开始有细胞结节形成,周围细胞呈放射状排列,部分细胞出现细长突起并呈极性排列;4周左右细胞团中央Von Kossa染色为阳性.③在诱导开始后1周,细胞处于活跃的增殖期,以后细胞增殖变慢,3周后多数细胞处于G0G1期.结论 实验成功建立了成牙本质细胞样细胞体外培养体系,所获得的成牙本质细胞样细胞具有成牙本质细胞的部分形态和生物学功能,诱导分化后细胞增殖变慢,是研究成牙本质细胞的较好模型.
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彗星试验检测大鼠牙髓细胞DNA降解推断死亡时间的研究
目的在特定条件下,用彗星试验技术,动态观察SD大鼠死后6～36 h牙髓细胞DNA降解规律,探讨推断死亡时间的一种方法.方法模拟广州地区近5年秋季10月份的平均气温25.1℃,建立SD大鼠死亡模型.分别于死后6、12、24、36、48 h提取大鼠牙髓组织进行彗星试验,荧光显微成像系统采集图像,同时获取多个分析参数(Comet4.0),并进行统计学处理.结果在死后6～36 h,SD大鼠牙髓细胞DNA的碎片随着死后间隔时间的延长而增加;尾长在死后各时间点依次呈明显的上升趋势;Oliver尾矩和尾DNA随着死亡时间的延长,也均有一定的上升趋势.结论本研究提示细胞DNA的降解随着死后间隔时间的延长而增加;尾长随着死后间隔时间的延长在各时间点呈明显的上升趋势,用于推断死亡时间优于Oliver尾矩和尾DNA.
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RUNX2突变牙髓细胞转化生长因子-β相关信号通路基因表达的分析
目的 利用第二代功能分类基因芯片检测颅骨锁骨发育不良患者成骨细胞特异性转录因子(runt-related gene 2,RUNX2)基因突变的牙髓细胞在转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)-骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信号传导通路上的基因表达差异.方法 利用本课题组前期成功分离培养的携带RUNX2致病基因突变的牙髓细胞,通过第二代TGF-β/BMP信号传导通路功能分类基因芯片,进行实时定量PCR基因芯片,检测携带突变的颅骨锁骨发育不良患者牙髓细胞与正常牙髓细胞的基因表达差异,进行数据分析.结果 基因芯片的实时定量PCR结果分析表明,在TGF-β/BMP信号传导通路上,RUNX2基因突变的牙髓细胞有18条基因表达上调,14条基因表达下调.结论 RUNX2基因可能通过调节TGF-β/BMP信号传导通路相关基因表达而影响牙髓细胞生物学特性.
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Notch信号及自噬在三氧化矿化聚合物促人牙髓细胞体外分化中的作用
目的 探讨Notch信号及自噬在三氧化矿化聚合物(mineral trioxide aggregate,MTA)促人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)体外分化的作用.方法 体外培养hDPCs,采用荧光定量PCR法检测MTA作用不同时间(24 h、3 d、7 d)对hDPCs碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、核心结合蛋白因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)及牙本质涎磷蛋白(dentin sialophoprotein,DSPP)表达的影响;Von Kossa染色观察细胞钙化结节形成的变化;Western Blot法检测MTA作用下hDPCs Notch信号及自噬相关蛋白表达的变化.结果0.1 mg/mL MTA即可促进体外培养hDPCs的分化.与未处理hDPCs的空白对照组相比,MTA组hDPCs的Notch信号成分Notch1、Hes1、Jagged1及自噬相关蛋白p62表达均明显增高,差异均有统计学意义(P<0.05).以自噬体与溶酶体融合抑制剂Bafilomycin A1(BAF)刺激细胞,自噬潮受抑制,Notch1表达升高,MTA具有类似作用.结论 MTA可显著促进hDPCs的体外分化,其作用机制可能与Notch1-Jagged1-Hes1信号转导途径激活及自噬抑制有关.
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HtrA1、TGF-β1及Smad3在人牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中的动态表达研究
目的:探讨人牙髓细胞(hDPCs)经矿化诱导向成牙本质细胞分化过程中丝氨酸蛋白酶HtrA1、转化生长因子(TGF)-β1和Smad3的表达情况.方法:建立体外培养的hDPCs矿化诱导模型,根据矿化时间分为0d、7d、14 d、21d、28 d组,通过茜素红染色、碱性磷酸酶(ALP)活性测定、矿化相关因子ALP、Ⅰ型胶原(COL Ⅰ)及成牙本质细胞标志因子牙本质涎磷蛋白(DSPP) mRNA的表达证实hDPCs成牙本质细胞向分化并成功建立体外矿化模型,用实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测矿化诱导过程中细胞内HtrA1、TGF-β1和Smad3 mRNA的表达情况.结果:矿化诱导后,与对照组比较,矿化结节产生逐渐增多,hDPCs细胞内ALP活性增强(P＜0.05).qPCR结果显示,诱导后细胞的ALP、COL Ⅰ及DSPP mRNA表达水平增高(均P ＜0.05).各时间点HtrA1和TGF-β1 mRNA的表达均高于0d组(均P＜0.05),Smad3 mRNA的表达有下降趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论:HtrA1、TGF-β1可能共同参与hDPCs向成牙本质细胞样细胞分化的过程,Smad3在这一过程中扮演的角色仍需要进一步的研究.
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骨髓间充质干细胞与牙髓细胞共培养细胞特性的体外研究
目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)与牙髓细胞(DPCs)体外共培养后细胞增殖、分化的生物学特征,探讨采用BMMSCs与DPCs共培养获得牙髓再生组织工程学种子细胞的可行性.方法:分别在体外分离培养大鼠BMMSCs和DPCs,并分别传至第3代.通过成骨及成脂诱导进行BMMSCs鉴定.取第3代DPCs和BMMSCs分为3组,(1)DPCs组;(2)共培养组;(3) BMMSCs组.共培养时间为6d,取出细胞半定量聚合酶联反应检测基质细胞抗原-1(Stro-1)及牙本质涎磷蛋白(DSPP)的基因表达量,并用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线.结果:①DPCs传至第3代后,细胞形态稳定均一,呈成纤维细胞样,长梭形;BMMSCs传至第3代后,细胞形态稳定均一,呈长梭形,平行排列或呈漩涡状生长,成脂成骨染色阳性.②细胞生长曲线示:共培养组的DPCs较DPCs组先进入指数生长期.共培养组BMMSCs较BMMSCs组后进入指数生长期.③Stro-1的表达量:BMMSCs组表达量高,共培养组BMMSCs表达量下降;DPCs组表达量低,共培养组DPCs表达量上升,差异有统计学意义(P =0.000).DSPP的表达量:共培养组DPCs较DPCs组表达量下降;共培养组BMMSCs较BMMSCs组表达量上升,差异有统计学意义(P=0.019).结论:BMMSCs与DPCs共培养,可以促进DPCs的增殖,以及有去分化的趋势;抑制BMMSCs的增殖,具有向DPCs分化的趋势.
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骨诱导形成蛋白-2诱导牙髓细胞矿化佳条件的探究
目的:探讨骨诱导形成蛋白-2(BMP-2)诱导人牙髓细胞(DPCs)矿化的佳条件.方法:将人DPCs进行体外培养稳定传代,用含不同浓度BMP-2(0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、150 μg/L)的诱导液培养14d,另用浓度为100 μg/L BMP-2诱导细胞,分别于7d、14d、21 d检测各组细胞增殖情况、矿化结节的形成情况以及诱导成牙本质过程中相关牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质基质蛋白-1(DMP-1)、碱性磷酸酶(ALP)基因的表达水平.结果:不同浓度BMP 2诱导细胞过程中,诱导液浓度的改变对细胞增殖无明显作用;一定范围内随着诱导剂剂量的增加,DPCs矿化结节形成量,DSPP、DMP-1、ALP基因表达量上调,各浓度与对照组(BMP-2为0 μg/L)比较,差异有统计学意义(P＜0.05),100 μg/L组和50 μg/L组之间的表达量比较,差异有统计学意义(P＜0.05),100 μg/L组和150 μg/L组比较差异无统计学意义(P＞0.05).在100 μg/L浓度BMP-2诱导下,0～14 d各表达明显增长,14d组与7d组各表达量差异有统计学意义(P＜0.05),而14 d组与21 d组各表达量差异无统计学意义(P＞0.05).结论:BMP-2对DPCs增殖无明显作用,但有明显诱导细胞矿化作用,佳浓度为100 μg/L,佳天数为14 d.
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不同生物活性胶原支架对人牙髓细胞生长能力的影响及可能分子机制的探讨
目的:研究不同生物活性胶原支架对人牙髓细胞生长能力的影响及可能的分子机制.方法:分离培养人牙髓细胞,接种在胶原支架材料(COL)、胶原-生物活性玻璃支架材料(COL-BG)、胶原-生物活性玻璃-聚己内酯支架材料(COL-BG-PCL),检测细胞生长能力及相关基因的表达.结果:COL-BG-PCL组hDPSCs的吸光值、迁移率以及上清液中ALP含量均高于COL组、COL-BG组;COL-BG-PCL组的Oct4A、NICD、HMGB1、SDF1、DSPP、DMP-1含量均高于COL组和COL-BG组.结论:COL-BG-PCL复合材料有助于促进hDPSCs的增殖、迁移和分化过程,可能的分子机制是增加Oct4A、NICD、HMGB1、SDF1、DSPP、DMP-1的表达.
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辛伐他汀在口腔颌面部应用的研究进展
辛伐他汀，3-羟基，3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA）抑制剂，他汀类药物的一种，通常作为降胆固醇药物用于降低高胆固醇血症患者的心血管病危险。近几年来，研究者们逐渐把目标转移到他汀类药物的潜在应用上。本文就辛伐他汀在口腔颌面部的应用做一综述。
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人牙髓细胞的体外培养及生物学特性研究
目的:从年轻恒牙的牙髓组织中分离培养牙髓细胞,研究其表型及生物学特性.方法:选取因正畸或阻生拔除的年轻健康双尖牙或第三磨牙,取出牙髓,组织块酶消化法分离培养人牙髓细胞,免疫细胞化学检测第3代人牙髓细胞表面标志,并对体外培养的人牙髓细胞的矿化能力进行研究.结果:体外培养的人牙髓细胞表达Ⅰ型胶原及波形丝蛋白,少数细胞增殖可形成克隆并表达间充质干细胞的表面标志STRO-1.体外连续培养可形成钙化结节,加入矿化诱导液后钙化结节形成时间明显提前,牙髓细胞碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性增高.结论:人牙髓细胞中含有少量干细胞,体外培养的人牙髓细胞可向成牙本质细胞分化并形成钙化结节,体外矿化诱导可促进牙髓细胞向成牙本质细胞分化.
