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人牙髓细胞体外培养及向成牙本质细胞的诱导分化
目的:观察体外培养的牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中碱性磷酸酶的表达和矿化结节形成能力,建立成牙本质细胞样细胞体外培养体系.方法:实验于2004-07/2005-07在中山大学光华口腔医学院完成.利用组织块酶解法培养人牙髓细胞并进行鉴定,取第3代牙髓细胞,胰酶消化后进行细胞计数,连续观察7 d,绘制生长曲线.第3代牙髓细胞,使用矿化诱导液诱导其向成牙本质细胞样细胞分化,观察细胞形态改变和碱性磷酸酶活性变化,用Von kossa染色法观察诱导后的细胞形成矿化结节的能力.结果:①获得的牙髓细胞均为波形丝蛋白阳性,角蛋白阴性,证明为中胚层来源的细胞.②诱导分化的牙髓细胞在2周左右进入复层生长期;3周左右开始有细胞结节形成,周围细胞呈放射状排列,部分细胞出现细长突起并呈极性排列.4周左右细胞团中央Von Kossa染色为阳性.③与未诱导的细胞相比,矿化诱导开始3周碱性磷酸酶活性逐渐升高,但到第4周后活性有所降低.结论:实验成功建立了成牙本质细胞样细胞体外培养体系,所获得的成牙本质细胞样细胞具有成牙本质细胞的部分形态和生物学功能,是研究成牙本质细胞的较好模型.
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壳聚糖/磷酸三钙复合组织工程支架材料的制备及其性能
背景 通过适当的工艺混合、加工来制备复合支架材料,可以弥补单一材料的不足,大限度地满足组织工程的需要.目的 制备壳聚糖/磷酸三钙复合支架,探讨其作为牙髓组织工程支架材料的可行性.方法 壳聚糖粉末溶于微量冰醋酸溶液中,搅拌均匀,静置脱泡,预冷冻,交联,再次冷冻制成海绵状多孔壳聚糖/磷酸三钙支架.结果 与结论 冻干法制备的壳聚糖/磷酸三钙多孔支架平均孔隙率达85.78%,高孔隙率达90%以上,孔径在100~300 μm,复合后的支架材料具有良好的韧性,当轴向压缩变形量超过5 mm 时,材料仍然没有发生破坏.材料浸提液与牙髓细胞复合培养后,细胞毒性均为0 级,由此可见壳聚糖/磷酸三钙复合材料具有良好的生物相容性、细胞亲和性和一定的力学性能,满足生物材料基本要求.
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富血小板血浆与洗涤血小板对人牙髓细胞矿化的作用
背景:此前课题组的研究表明富血小板血浆和洗涤血小板在一定浓度范围内均可促进人牙髓细胞的增殖.目的:进一步观察不同浓度富血小板血浆和洗涤血小板对人牙髓细胞矿化的作用效果.方法:实验使用健康志愿者正畸拔除牙齿内牙髓培养的4～6 代牙髓细胞.将由该志愿者采集的静脉血制备富血小板血浆和洗涤血小板作用于牙髓细胞,使用碱性磷酸酶及蛋白定量试剂盒测定矿化诱导7 d 后牙髓细胞的碱性磷酸酶活性,并通过茜素红染色观测牙髓细胞经矿化诱导10 d 及20 d 后的矿化结节形成情况.结果与结论:10%～30% 的洗涤血小板与富血小板血浆均明显提高了牙髓细胞碱性磷酸酶活性,其中,以20%浓度尤为明显;10%～30% 的洗涤血小板与富血小板血浆均明显促进了矿化诱导后10 d 的牙髓细胞矿化结节形成,其中,10% 浓度在矿化诱导后20 d 促进牙髓细胞形成的矿化结节大.但相同浓度的洗涤血小板与富血小板血浆之间在作用效果上没有明显差异.
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骨形态发生蛋白2基因转染犬牙髓细胞
背景:研究发现骨形态发生蛋白2具有诱导间充质细胞向成骨细胞表型分化以及诱导新骨及修复性牙本质形成的能力.目的:通过对细胞超微结构的分析,探讨骨形态发生蛋白2基因转染的犬牙髓细胞,向成牙本质细胞转化的过程.方法:将培养的性状稳定的第4代犬牙髓细胞分为3组:基因转染组转染pEGFP-N1-BMP-2基因,空白载体转染组转染EGFP-N1空白荧光载体,未转染组不转染.结果与结论:成功构建pEGFP-N1-BMP-2真核表达质粒,并成功将其转染犬牙髓细胞,pEGFP-N1-BMP-2质粒转染促进犬牙髓细胞分泌骨形态发生蛋白2.pEGFP-N1-BMP-2质粒转染有促进牙髓细胞碱性磷酸酶活性的作用.透射电镜观察结果显示:转染后的犬牙髓细胞具有成牙本质细胞的形态特点.说明pEGFP-N1-BMP-2 真核表达质粒转染后的牙髓细胞,具有成牙本质细胞的特征.
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构建骨缺损植入材料非人灵长类动物模型的研究与进展
背景:近年来,骨缺损疾病的发生率不断升高,自体骨和同种异体骨用于治疗骨缺损又受到各方面的限制,研制并筛选出能有效解决这个问题的骨缺损修复材料愈发受到关注.目的:综述近年来各类骨缺损植入材料修复非人灵长类动物骨缺损疾病的研究进展.方法:检索PubMed数据库及CNKI中国期刊全文数据库等数据库收录的有关构建骨缺损植入材料动物模型的实验研究及进展情况的文章.英文检索词为"bone defect,implant material,repair,non-human primate,animal model";中文检索词为"骨缺损、植入材料、修复、非人灵长类、动物模型".纳入与骨缺损植入材料及其动物模型的实验研究及进展情况相关性高的文献共计40篇.结果与结论:对近年来骨缺损植入材料的非人灵长类动物模型的研究现状进行调查,发现近年来骨缺损植入材料的非人灵长类动物模型的相关研究较少,而且文章之间关联性较低,但研究结果良好.单一成分骨缺损植入材料已在临床上得到了广泛的应用,但几种成分复合而成的骨缺损植入材料却鲜有报道应用于临床治疗,主要研究还停留在动物实验阶段.其中研究复合有骨生长因子如骨形态发生蛋白2、转化生长因子β等或种子细胞(如骨髓间充质干细胞及牙髓干细胞等)的复合材料较多.
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牙髓细胞成牙本质分化的体外诱导：诱导因子及机制揭示
背景：研究表明牙髓细胞在一定条件下经诱导可以向成牙本质细胞方向分化，该过程由信号网络调控。目的：综述牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化的诱导因子及作用机制的研究进展。方法：应用计算机检索1998年1月至2014年7月中国知网(CNKI)和万方数据库相关文献，检索词“牙髓细胞，成牙本质细胞分化”限定文献语言种类为中文。同时计算机检索同期PubMed数据库相关文献，检索词“dental pulp cel s，odontoblastic differentiation”，限定文献种类为英文。初检所得文献467篇。包括中文214篇，英文253篇。对于初检文献，阅读标题和进行初筛，排除因研究目的与本研究无关者或内容重复性的研究，终纳入63篇文章进行综述。结果与结论：不同的诱导因子可以作为调控器，文章系统归纳了牙髓细胞在不同的诱导因子作用下，例如：骨形态发生蛋白、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸及多种生长因子等，通过相关信号通路信号转导在一定程度上参与牙髓细胞向成牙本质细胞分化定向诱导。但成牙本质细胞分化是一个复杂的过程，进一步从细胞及分子水平研究成牙本质分化诱导因子及相关机制对于牙齿再生治疗临床应用具有重要意义。
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人细胞外基质磷酸化糖蛋白对人牙髓细胞生长和黏附的影响
目的 探讨细胞外基质磷酸化糖蛋白(MEPE)对人牙髓细胞(HDPCs)黏附、伸展、增殖的影响.方法 常规培养获得人牙髓细胞,各实验组中MEPEs的浓度分别为0.01,0.1,1,10,100μg/L 以不加MEPE作为空白对照组.细胞计数法测定细胞的黏附能力; 通过计数高倍视野中伸展的细胞数,计算骨髓基质细胞在不同时间的伸展率; MTT法检测各组细胞的增殖活性.结果 体外培养的人牙髓细胞生长良好; 各实验组间及与对照组比较,100 μg/L 组对细胞的黏附性的影响有差异; 各组细胞的伸展率无差异;MEPE对人牙髓细胞有较明显的促增殖作用.结论 MEPE对体外培养的人牙髓细胞的伸展率无影响,但可明显促进其黏附性和增殖.
关键词： 细胞外基质磷酸化糖蛋白 牙髓细胞 黏附 增殖 -
过表达Runx2基因对牙髓细胞分化相关基因的影响
目的 探讨Runt相关转录因子(Runx)2基因在人牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中的作用.方法 通过矿化诱导培养基(1μmolβ-磷酸甘油钠、10-6μmol地塞米松和5 mg抗坏血酸)建立牙髓细胞向成牙本质细胞分化模型,通过检测碱性磷酸酶(ALP)的活性鉴定模型.将过表达载体pcDNA3.1-Runx2和空载体pcDNA3.1(阴性对照组)转染牙髓细胞,蛋白质免疫印迹法检测转染后细胞中Runx2蛋白的表达量;实时定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中成牙本质细胞分化相关基因牙本质涎磷蛋白(DSPP)、骨涎蛋白(BSP)mRNA的表达.结果 在人牙髓细胞向成牙本质细胞分化的过程中,ALP的活性含量逐渐增加,第14天的水平显著大于第7天(P<0.05).与阴性对照组相比,pcDNA3.1-Runx2组细胞中Runx2蛋白的表达量显著升高(P<0.05);在分化诱导的第7和14天,细胞中DSPP mRNA(P<0.05)、BSP mRNA(P<0.05)均显著高于阴性对照组.结论 Runx2通过增加成牙本质细胞分化相关基因的表达,从而促进牙髓细胞向成牙本质细胞分化.
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不同浓度bFGF对体外培养人牙髓细胞增殖的影响
目的:探讨不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养人牙髓细胞增殖的影响,为寻求佳影响浓度提供参考依据.方法:以常规组织块培养法体外获得牙髓细胞,随机分为5组,实验组分别加入bFGF,使其终浓度为0.1、1.0、10.0及100.0μg·L-1,无bFGF组作为阴性对照.采用MTT法分别测定各组吸光度A值,计算细胞相对增殖率(RGR),观察bFGF对牙髓细胞的增殖作用.结果:人牙髓细胞在不同浓度bFGF的作用下,除0.1 μg·L-1 bFGF组外,其他实验组RGR均高于对照组(P＜0.01);组间比较显示10.0μg·L-1 bFGF组RGR高,与1.0 μg·L-1 bFGF组比较差异有显著性(P＜0.01),但与100.0 μg·L-1bFGF组比较差异无显著性(P＞0.05).结论:bFGF能促进人牙髓细胞的增殖,bFGF的小显效浓度是1.0μg·L-1,佳增殖浓度是10.0 μg·L-1.
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RANKL在人乳牙根生理性吸收不同时期不同细胞的表达
目的:探讨核因子κB受体活化剂配体(receptor activator of the nuclear factor-κappaB ligand,RANKL)在人乳牙根消失不同时间段牙髓细胞内的表达及分化.方法:临床选取牙根生理早中晚期的乳牙各10颗,用原位杂交方法检测RANKL细胞因子在人的乳牙根消失的时候不同时期牙髓细胞内的mRNA表达情况.结果:牙髓细胞、成牙本质细胞RANKL原位杂交染色阳性,表达比对照组高(P＜0.05).消失比较早的时候与消失中、晚的时候,比较各种细胞内RANKL表达差异有统计学意义(P＜0.05),而消失中间的时候和消失比较晚的各种细胞内的RANKL表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论:RANKL参与了乳牙牙根的消失过程,牙髓细胞、成牙本质细胞可能促进了破骨细胞分化成熟.
关键词： 核因子κB受体活化剂配体 乳牙根生理性消失 牙髓细胞 原位杂交 -
Notch信号及自噬在三氧化矿化聚合物促人牙髓细胞体外增殖中的作用
目的:探讨Notch信号及自噬在三氧化矿化聚合物(MTA)促人牙髓细胞(hDPCs)体外增殖中的作用.方法:取临床上完整拔除的健康第三磨牙,通过酶消化法获得原代培养hDPCs.采用CCK-8比色法检测不同浓度(0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/mL) MTA对hDPCs增殖的影响,筛选出佳促增殖作用浓度和作用时间.通过Western Blot法检测MTA作用下hDPCs Notch信号及自噬相关蛋白表达的变化.结果:1.0 mg/mL MTA对体外培养hDPCs促增殖作用显著,高浓度MTA (10 mg/mL)则具有一定的细胞毒性.与未处理hDPCs相比,MTA处理组hDPCs的Notch1、Hes1表达(P＜0.05)及自噬相关蛋白P62及LC3Ⅱ/Ⅰ表达(P＜0.01)均显著增高.平衡盐溶液(EBSS)饥饿实验诱导自噬发生后Notch1表达水平显著下降.结论:MTA可显著促进hDPCs的体外增殖,其作用机制可能与Notch1-Hes1信号转导途径激活及自噬抑制有关.
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TGF-β受体Ⅰ型、Ⅱ型在实验性鼠牙髓炎中的免疫组化研究
转化生长因子-β(transforming growth factor,TGF-β)是一族具有多种生物学功能的细胞因子,对细胞的形态发生、增殖和分化过程起着重要作用,有利于胚胎发育和细胞修复,参与牙胚的发生、发展、成熟以及牙体组织的修复过程[1].在哺乳动物,已发现7种Ⅰ型受体和5种Ⅱ型受体[2].转化生长因子受体(TGF-βR)包括TGF-βR Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型3种形式.TGF-βR Ⅰ、Ⅱ参与了牙胚的发育及成牙本质细胞、成釉细胞的分化.TGF-βR Ⅰ、Ⅱ在鼠、牛以及人第三磨牙牙髓细胞、成牙本质细胞的表达均有报道[3].
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牙髓细胞和肋软骨细胞共培养形成组织工程软骨的胶原类型分析
目的：研究牙髓细胞和肋软骨细胞共培养形成的组织工程软骨的胶原类型。方法：人肋软骨细胞和牙髓细胞按1∶1的比例用微团法共培养来促进其向软骨细胞分化。应用苦味酸天狼猩红染色，偏正光检测法研究形成的组织工程软骨胶原类型，并与颅颌面区域软骨进行比较。结果：肋软骨细胞和牙髓细胞微团法共培养形成的组织工程软骨中以I型胶原为主，同时包括II和III 型胶原纤维，其纤维结构组成与肋软骨、髁突软骨增殖层及颞下颌关节盘的纤维结构相似。结论：肋软骨细胞和牙髓细胞共培养可形成的组织工程软骨，其组织结构与纤维软骨相似。
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富血小板纤维蛋白对牙髓细胞增殖与分化的影响
目的：评估牙髓细胞在富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin, PRF）存在下的体外增殖及成骨分化的能力，为PRF作为支架材料、牙髓细胞作为种子细胞构建组织工程骨，进行前期研究。方法：3月龄比格犬拔除乳磨牙获得乳牙牙髓细胞；恒牙牙髓细胞从16月龄成年比格犬磨牙获得。静脉取血离心10 min获得PRF。实验分4组：对照组（普通培养基不加入PRF）；实验组A（普通培养基加入PRF）；实验组B(成骨诱导培养基不加入PRF)；实验组C（成骨诱导培养基加入PRF）。分别于1、4、7和11d测定细胞数量、MTT值、半定量碱性磷酸酶值、成骨相关基因Q-PCR值，并于21d测定钙结节吸光度值。结果：PRF是一种可以促进牙髓细胞增殖的，无毒性作用的纤维网状支架结构；细胞水平上PRF促进了两种细胞的成骨分化：钙结节以及碱性磷酸酶半定量数值都明显上调（P<0.05）；基因水平上，4个时间点成骨相关基因的表达量都显著增加（P<0.05），且乳牙牙髓细胞的表现均优于恒牙牙髓细胞。结论：可使用PRF和牙髓细胞复合构建组织工程骨。
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硅酸钙生物陶瓷对牙髓细胞体外增殖分化的影响
目的:应用硅酸钙(CaSiO3,CS)生物陶瓷作用于人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs),研究其对hDPCs增殖及向成牙本质细胞方向分化的影响.方法:从年轻健康患者(18～20岁)拔除的智齿或前磨牙牙髓组织中获取hDPCs进行培养.将质量浓度为0.2 g/mL的CS浸提液按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64和1/128倍比稀释后作用于hDPCs. MTT实验检测不同质量浓度CS浸提液对hDPCs增殖的影响,进而筛选出佳浓度.以佳质量浓度(1/64倍比稀释)CS浸提液培养hDPCs 2、4d后,Real-Time PCR检测以下hDPCs成牙本质相关基因的表达:牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein 1,DMP-1),Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ,COL-Ⅰ)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN);培养7、14 d后碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及半定量检测ALP活性.结果:佳质量浓度(1/64倍比稀释)CS浸提液能够促进hDPCs的增殖,对牙髓细胞DSPP、DMP-1、COL-1、OPN等成牙本质相关基因的表达有较为明显的促进作用.ALP染色及半定量分析显示该浓度的CS浸提液能够提高hDPCs分泌ALP的活性.结论:佳质量浓度(1/64倍比稀释)CS浸提液能够明显促进hDPCs的增殖,提高成牙本质相关基因的表达,进而促进hDPCs向成牙本质细胞方向分化,为后期hDPCs结合CS支架材料进行牙本质再生的研究打下基础.
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脂多糖对大鼠牙髓细胞ALP、BSP、DSPP表达的影响
目的:研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对大鼠牙髓细胞牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表达的影响.方法:采用组织块法获得大鼠牙髓细胞,体外常规培养并进行鉴定,以含0.1、1、10、100和10000 ng/mL牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)的LPS作用牙髓细胞1、3、5d,用实时定量PCR检测DSPP、ALP、BSP mRNA表达的变化,采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析.结果:镜下贴壁后的细胞形态多样,多呈成纤维样细胞形态,还有部分多角形细胞,胞质突起.实时定量PCR结果显示,与对照组相比,1、10 ng/mL LPS组大鼠牙髓细胞DSPP、ALP、BSP的mRNA表达增高,100、10000 ng/mL LPS组DSPP、ALP、BSP的mRNA表达均降低;在1、3、5d时,1、10、100和10000 ng/mL LPS组mRNA表达逐渐减少.0.1 ng/mL LPS对mRNA的表达无显著影响.3种因子呈现相似的表达变化趋势.结论:低剂量P.g LPS能促进牙髓细胞ALP、BSP、DSPP的表达,高剂量时则抑制ALP、BSP、DSPP的表达;随着培养时间的延长,促进作用逐渐减弱,抑制作用逐渐增强.
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一氧化氮对人牙髓细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响
目的:观察一氧化氮(nitric oxide,NO)对人牙髓细胞生物学特性的影响.方法:利用组织块法培养人牙髓细胞,取生长良好的第3代细胞,在正常培养基与促矿化培养基中分别加入浓度为10μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的NO供体亚硝基化合物-18(NOC-18),通过MTT检测细胞增殖能力,测定细胞ALP活性.采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析,检测NOC-18对牙髓细胞增殖和ALP活性的影响.结果:NOC-18呈浓度依赖性地抑制牙髓细胞的增殖;在促矿化培养基中,牙髓细胞体现出更高的ALP活性,呈浓度依赖性增强,但在正常培养基中却没有变化.结论:NO对牙髓细胞的生物学活性有较大影响,提示NO在修复性牙本质形成与牙髓炎的发生、发展中起到一定作用.
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TGF-β1在氟中毒大鼠切牙牙髓中的表达
目的:研究过量氟对大鼠牙髓细胞TGF-β1表达的影响.方法:20只Wister大鼠,随机分为对照组和实验组.对照组用等量蒸馏水灌胃,实验组以20mg.kg-1.d-1氟化钠水灌胃.8周后处死动物,利用磨片、HE染色、免疫组化染色技术观察过量氟对大鼠切牙形态及TGF-β1表达的影响.采用SPSS10.0软件对数据进行t检验.结果:实验组大鼠切牙釉质牙本质生长线明显,球间牙本质增多,牙髓细胞及髓腔内侧牙本质TGF-β1表达显著弱于对照组,差异有显著性(P＜0.01).结论:过量氟可抑制牙髓细胞表达TGF-β1,影响牙体硬组织的结构.
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肝细胞生长因子在正常牙髓组织中的表达
目的:检测肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)在体外培养的牙髓细胞及正常牙髓组织中的表达.方法:以体外培养的第4代牙髓细胞及因正畸拔出的离体牙为实验对象,应用逆转录-聚合酶联反应(real-timereserve transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)半定量技术,从基因转录水平检测体外培养的牙髓细胞中HGF及其受体C-MET基因的表达,以及外源性HGF作用下C-MET基因表达的变化;应用免疫组化法,检测体外培养的牙髓细胞及健康离体牙的牙髓组织中HGF的表达,并对其进行定位.采用SPSS10.0统计软件包对数据进行SNK-q法检验.结果:体外培养的牙髓细胞中可检测出HGFmRNA及C-METmRNA的表达,C-METmRNA的表达可被外源性HGF上调.HGF在体外培养的牙髓细胞胞质中呈阳性表达,胞核阴性表达;在健康离体牙的牙髓组织成牙本质细胞层和血管内皮细胞胞质中均呈弱阳性表达,胞核阴性表达.结论:HGF在体外培养的牙髓细胞及健康离体牙的牙髓组织中均有表达.
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脂多糖对人牙髓细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响
目的:了解脂多糖(LPS)对人牙髓细胞的增殖和碱性磷酸酶活性的影响.方法:Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养牙髓细胞,检测细胞表面LPS受体CD14(mCD14);流式细胞术观察不同浓度LPS(0.1μg/ml、1μg/m1和10μg/m1)对牙髓细胞细胞周期的影响,测定不同浓度LPS对牙髓细胞碱性磷酸酶活性的影响,采用x2检验以及单因素方差分析对实验数据分别进行统计学分析.结果:人牙髓细胞不表达mCD14,LPS在浓度为0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml时可以抑制牙髓细胞增殖(P＜0.01)及碱性磷酸酶活性(P＜0.05).结论:LPS具有抑制牙髓细胞增殖及牙髓细胞分化的作用.
