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富血小板血浆诱导脂肪干细胞成骨作用的实验研究
目的 探讨在体外培养中富血小板血浆(PRP)对脂肪干细胞的增殖及诱导成骨的影响.方法 从Wistar大鼠自体动脉血中提取PRP,配制成条件培养液,并作用于培养状态的脂肪干细胞,MTT法检测细胞的增殖情况,Kaplow法染色检测细胞碱性磷酸酶表达情况,碱性磷酸酶活性检测,茜素红染色鉴定钙结节形成情况.结果 脂肪干细胞经诱导培养后,PRP诱导组较对照组增殖明显(P＜0.01),碱性磷酸酶活性较对照组增高明显(P＜0.01),PRP诱导组碱性磷酸酶染色阳性,茜素红染色可见钙结节形成.结论 体外培养时,PRP可促进脂肪干细胞的增殖并能诱导成骨分化,从而为骨组织工程提供一种新的方法.
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骨髓间充质干细胞诱导成骨细胞模型中活化转录因子4基因的表达
背景：研究发现活化转录因子4为近调控成骨细胞分化和功能的活化因子，在成骨细胞分化过程中起着至关重要的作用。
目的：探索SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导过程中活化转录因子4基因的表达变化及其意义。
方法：以全骨髓贴壁法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，传代至第3代细胞时加入成骨诱导剂，在诱导的第0，1，4，7，10，13，16，19天分别采用PT-PCR，Western blot动态监测活化转录因子4基因及蛋白的表达变化，以未进行成骨诱导细胞做对照。
结果与结论：RT-PCR结果显示，活化转录因子4 mRNA的表达随着细胞成骨分化程度加剧而升高，16 d达到峰值。Western blot分析结果显示，活化转录因子4蛋白表达量随着骨髓间充质干细胞骨化程度加剧，表达水平亦呈上升趋势，于16 d达到高峰，19 d维持在高水平状态。实验组各时间点活化转录因子4 mRNA和活化转录因子4蛋白表达与对照组相比差异有均有显著性意义(P<0.05)。结果表明诱导成骨细胞中活化转录因子4表达增强，提示活化转录因子4的增强与骨髓间充质干细胞成骨分化能力呈正相关。 -
比较3种形态学方法观察成骨细胞矿化结节的应用价值
背景：矿化结节是成骨细胞分化成熟的标志，以往观察方法多采用茜素红等特殊染色法。
目的：比较茜素红染色-光镜、四环素荧光标记-激光扫描共聚焦显微镜、扫描电镜3种形态学观察成骨细胞矿化结节的方法，分析各自的特点及在骨病研究中的应用价值。
方法：将大鼠成骨细胞株UMR-106正常培养、每天换液，连续培养14 d，分别采用茜素红染色-光镜、四环素荧光标记-激光扫描共聚焦显微镜、扫描电镜观察矿化结节的形态结构，并利用扫描电镜结合能谱仪原位定量分析钙元素；此外，在培养中加入可抑制成骨细胞增殖、分化的肿瘤坏死因子α作为对照实验。
结果与结论：3种观察方法均可观察到正常成骨细胞矿化结节的形态结构。对于肿瘤坏死因子α抑制成骨细胞产生矿化结节的情况，经茜素红染色-光镜观察法，未见明显的矿化结节；而四环素荧光染色-激光扫描共聚焦显微镜观察法，可见清晰、稀少的矿化结节；扫描电镜观察法明显可见较少而细小的矿化结节，提示后二种方法灵敏度较高。此外，扫描电镜可将观察成骨细胞分泌钙质、形成矿化结节的亚细胞结构，与能谱元素分析结合，可实现矿化结节的定位与定量，在骨病研究中值得推广应用。 -
人羊膜间充质干细胞体外大量扩增的方法
背景：一个胎盘羊膜的面积约600 cm2，羊膜来源间充质干细胞即取材于胎盘上的羊膜。
目的：建立一种简单的体外分离培养人羊膜来源间充质干细胞的方法，并分析其生物学特性。
方法：采用胰酶和直接贴壁相结合的方法分离获取人羊膜来源间充质干细胞并进行体外培养，观察细胞形态，分析传代第5代细胞生长曲线，检测第5代细胞表面标志表达和检测细胞周期。取传代第4代细胞行体外成骨细胞诱导和成脂诱导，冻存第4代细胞6个月后复苏，计数复苏后细胞存活率并绘制复苏细胞生长曲线。
结果与结论：原代接种后第9天有少许细胞爬出，15 d左右细胞达80%-90%融合，细胞以梭形为主。细胞传代后，细胞形态均一，螺旋状排列。传代细胞潜伏期48 h，对数增殖期4 d左右，对数增殖期后进入平台期。间充质干细胞表面CD34、CD14、CD19、CD45、HLA-DR 呈阴性表达，CD73、CD105、CD90呈阳性表达。茜素红染色及油红O染色阳性，证实具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力。流式细胞术细胞周期检测，S期占28%。冻存复苏后细胞存活率达90%以上，且与未冻存传代细胞具有相同的生长特性。结果证实实验成功地建立了一种简化的人羊膜来源间充质干细胞大量扩增的方法。 -
转化生长因子β3对人乳牙牙髓干细胞增殖和矿化能力的影响
背景：目前已有研究报道转化生长因子β超家族对各类干细胞成骨矿化的作用，但转化生长因子β3与肝素联合作用后对人乳牙牙髓干细胞的增殖和矿化能力的作用仍有待研究。目的：观察转化生长因子β3对人乳牙牙髓干细胞增殖和矿化能力的影响。方法：采用酶消化法将人乳牙牙髓分离培养，测定细胞集落克隆形成率，流式细胞术鉴定细胞表面标记物CD146，细胞爬片行Vimentin和STRO1免疫化学染色进行人乳牙牙髓干细胞鉴定；对体外培养的第3代人乳牙牙髓干细胞给予肝素和质量浓度1，5，25μg/L的转化生长因子β3进行干预。MTS法测细胞生长曲线；茜素红染色；碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性的改变。结果与结论：实验所得细胞集落克隆形成率高，细胞表面标记物 CD146呈阳性， Vimentin和STRO1免疫化学呈强阳性，鉴定获得人乳牙牙髓干细胞。MTS结果显示，给予转化生长因子β3刺激人乳牙牙髓干细胞后并无明显的促增殖的作用。碱性磷酸酶活性检测结果显示，转化生长因子β3-肝素联合作用可随着浓度的增加而增强人乳牙牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性，其中质量浓度分别为5，25μg/L 转化生长因子β3和肝素联合作用组与转化生长因子β3单独作用组、肝素单独作用组以及对照组相比显著性升高(P<0.01)。转化生长因子β3-肝素联合作用组的茜素红染色均呈阳性，其中以5μg/L转化生长因子β3-肝素联合作用组染色强。结果证实，转化生长因子β3与肝素联合作用可促进人乳牙牙髓干细胞矿化能力。
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同轴电纺P3HB4HB/聚乙烯醇复合支架的制备及其生物相容性
背景:聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)[poly(3-hydroxybutyrate-4-hydroxybutyrate),P3HB4HB]是一种能够完全降解,具有良好的成膜性、物理性能的高分子材料,但其亲水性较差.目的:制备同轴电纺P3HB4HB/聚乙烯醇复合支架,通过体外实验探讨支架的物理属性及生物相容性.方法:分别制备P3HB4HB电纺支架、聚乙烯醇电纺支架及同轴电纺P3HB4HB/聚乙烯醇复合支架,检测3组支架的形貌、接触角及拉伸力学性能.将第4代SD大鼠骨髓间充质干细胞分别接种于3组支架上,接种1,3,6 h,检测细胞黏附率;接种第1,3,5,7天,MTT法检测细胞增殖;接种7 d后,荧光染色观察细胞活性.将第4代SD大鼠骨髓间充质干细胞分别接种于3组支架上,成骨及成软骨诱导分化14 d后,进行茜素红、甲苯胺蓝染色.结果与结论:①支架形貌:扫描电镜下,3组支架呈三维网状相互连通的结构,相互交错,P3HB4HB电纺支架、复合支架纤维直径较为均一,排列规整;透射电镜下仅复合支架可见明显的芯-壳结构;②支架表征:P3HB4HB 电纺支架、复合支架的拉伸强度、拉伸弹性模量及拉伸大力明显高于聚乙烯醇电纺支架(P <0.05);复合支架的接触角< 90°;③细胞黏附率:聚乙烯醇电纺支架组>复合支架组>P3HB4HB电纺支架组(P < 0.05);④细胞增殖及活性:复合支架组接种5,7 d的细胞增殖快于其余两组(P < 0.05);接种7 d后,聚乙烯醇电纺支架、复合支架上的活细胞多于P3HB4HB电纺支架;⑤细胞分化:复合支架组细胞的成骨和成软骨特异性染色强于其余两组;⑥结果表明:同轴电纺P3HB4HB/聚乙烯醇复合支架具有良好生物相容性和有一定力学强度.
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人脂肪干细胞的提取和鉴定
背景：脂肪干细胞是存在于脂肪中的全能干细胞，具备自我更新能力与多向分化潜能，遗传背景相当稳定，体内植入后免疫排斥少，是一种比较理想的种子细胞。目的：提取人大网膜脂肪干细胞，并进行成脂和成骨分化能力鉴定。
方法：收集手术患者大网膜的脂肪组织，经Ⅰ型胶原酶消化、过滤、离心后进行原代培养，观察细胞生长状态；用细胞计数法绘制人脂肪干细胞增殖曲线，计算处于对数生长期的倍增时间；用相应的定向诱导液诱导人脂肪干细胞向脂肪细胞及骨细胞方向分化，并用油红O染色、茜素红染色进行鉴定。
结果与结论：从手术患者大网膜脂肪组织中成功分离人脂肪干细胞，贴壁生长的人脂肪干细胞为长梭形，形态类似成纤维细胞。第3代人脂肪干细胞生长曲线呈S形，对数生长期人脂肪干细胞的倍增时间为45.90 h。人脂肪干细胞经成脂、成骨定向诱导分化2，3周后，油红O染色显示细胞内有大小不等的橘红色脂肪滴，茜素红染色可见着橘红色的典型钙化结节，提示所培养的脂肪干细胞具有向脂肪细胞、骨细胞系分化的能力。 -
基于雌激素受体研究氯化锂干预成骨细胞的分化及自噬
背景:临床应用锂治疗造血系统疾病和双极性疾病已经有数十年,并且发现锂可以直接刺激骨髓间充质干细胞的增殖.目的:研究雌激素受体抑制下氯化锂对大鼠成骨细胞增殖分化及自噬的影响.方法:实验选取10只出生72 h的SPF级SD乳鼠(由黑龙江中医药大学提供).采用酶消化法和茜素红染色法获得和鉴定成骨细胞.取对数生长期成骨细胞,于培养基中加入不同浓度的氯化锂(0,1,2,5 nmol/L)处理24 h,采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况.另取成骨细胞随机分为空白组(正常培养细胞)、抑制剂组(10-7 mol/L ICI 182780)、治疗组(5 nmol/L氯化锂+10-7 mol/L ICI182780).采用钙化结节染色及碱性磷酸酶活性检测各组成骨细胞分化情况;Western blot法测定各组成骨细胞中Beclin1和Runx2蛋白表达情况.结果与结论:①倒置显微镜下观察细胞多为单核、多边形及梭形,局部有细胞密集的细胞团;②CCK-8法检测结果显示不同浓度的氯化锂都能对成骨细胞增殖产生促进作用,呈浓度依赖性;③茜素红染色结果显示与空白组比较,抑制剂组成骨细胞矿化能力明显降低,与抑制剂组比较,治疗组成骨细胞矿化结节能力明显增加(P＜0.05);活性测定结果显示与空白组比较,抑制剂组中碱性磷酸酶活性明显降低,与抑制剂组比较,治疗组中碱性磷酸酶活性明显增加(P＜0.05);④Westem blot结果显示与空白组比较,抑制剂组中Beclin1和Runx2蛋白表达明显降低,与抑制剂组比较,治疗组中Beclin1和Runx2蛋白表达显著增加(P＜0.05);⑤结果提示,雌激素受体抑制下氯化锂可以提高大鼠成骨细胞增殖分化及自噬.
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PLGA/CPC支架材料复合骨髓基质干细胞构建组织工程骨的体外效果评价
目的:探讨聚乳酸聚羟基乙酸/磷酸钙骨水泥(PLGA/CPC)复合骨髓基质干细胞(BMSCs)构建组织工程骨的可行性,为预防剩余牙槽嵴萎缩和促进骨再生提供科学理论指导.方法:采用溶剂浇铸-粒子沥滤技术结合相分离法制备PLGA/CPC支架材料;体外分离、培养、纯化大鼠BMSCs;第3代BMSCs经Dil染色后接种于复合支架材料.实验分为实验组(PLGA/CPC+BMSCs)和对照组(单纯BMSCs).扫描电镜和激光共聚焦观察支架材料的孔隙率及BMSCs在支架上的黏附情况;CCK-8和碱性磷酸酶(AKP)法检测2组细胞增殖和分化.结果:支架材料孔隙率达90％以上,孔径平均为200～300 μm,支架材料与细胞黏附性较好;原代BMSCs前3d增殖较慢,3～6 d增殖较快,6d后增殖较慢;BMSCs表面抗原CD44和CD105均呈阳性表达;茜素红和Ⅰ型胶原染色,BMSCs有良好的成骨活性;Dil染色,细胞标记率达90％以上,标记物对细胞形态无明显影响.CCK-8和AKP法检测,实验组和对照组BMSCs增殖率和AKP活性差异无统计学意义(P＞0.05).结论:PLGA/CPC是理想的组织工程支架材料.
关键词： 骨髓基质干细胞 骨组织工程 聚乳酸羟基乙酸/磷酸钙骨水泥 茜素红染色 -
MC3T3-E1前成骨细胞培养时间对矿化结节表达的影响
目的:观察MC3T3-E1前成骨细胞不同培养时间点矿化结节的形态,探讨一个既节省实验时间与经费,又便于观察矿化结节形态差异的实验方法.方法:将MC3T3-E1前成骨细胞按培养时间分为四组(14、21、28、35天组),各组实验结束时行茜素红染色,光学显微镜下观察矿化结节的形态变化.结果:各组均见红色的矿化结节形成,随培养时间延长,染色面积增大,密度增高,14天时结节轮廓清晰,结节间距较大,21天时结节面积增大,28天时结节边界超出视野,35天时视野内大片深染,结节轮廓不清.结论:在本实验周期内,MC3T3-E1前成骨细胞培养14至21天通过茜素红染色可以较清晰地观察矿化结节,其中培养14天时即可观察到结节大小、数量及形态,考虑到实验时间及经费的因素,我们认为MC3T3-E1前成骨细胞培养14天后行茜素红染色是观察不同因素对其矿化产生影响的适宜时间点.
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聚乙烯醇对大鼠牙髓细胞矿化诱导能力的实验研究
目的:观察聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)对大鼠牙髓细胞的矿化诱导能力.方法:制备PVA涂层24孔板,分别以PVA、矿化诱导液对第4代SD大鼠牙髓细胞进行矿化诱导,通过定量的茜素红染色分析和碱性磷酸酶(ALP)活性检测比较二者的矿化诱导能力.结果:经PVA诱导的大鼠牙髓细胞,其ALP活性和茜素红分析在7d的培养过程中,显示明显持续增高的趋势(P<0.01).结论:PVA可诱导大鼠牙髓细胞矿化分化,有望成为组织工程化人工牙研究的支架材料.
