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热打击后小鼠肺和脑组织病理学的改变
目的 制备小鼠热打击模型,研究热打击和复温治疗过程中动物肺和脑组织的病理形态学改变.方法 BALB/c小鼠随机(随机数字法)分为对照组和热打击组,对照组动物始终置于(25±0.5)℃,湿度35±5%环境下,热打击组置于仿真高温气候舱内,舱内温度(35.5±0.5)℃,相对湿度(60±5)%,记录小鼠直肠温度(Tc),并按Tc分为39℃、40℃、41℃、42℃组,分别于Tc达到41℃后移置(25±0.5)℃,相对湿度(35±5)%环境下复温12 h组和24 h组和达到42℃后移置常温复温6 h组(n=6).分离动物肺和脑组织行HE染色,显微镜下观察并照相.结果 动物对热打击的Tc变化均一,低程度的热打击即可使肺部发生明显病理改变,进一步的热打击表现为进行性加重的间质血管显著扩张充血,大量肺泡腔出血,部分肺泡上皮细胞脱落,肺泡结构模糊不清,而复温则可以使病变明显减轻.脑组织在低程度的热打击时仅表现为轻度的脑水肿,随着打击程度的加重,除了脑水肿加重外,还渐进性出现神经元细胞变性坏死.在体温达到41℃后复温则病变有所减轻,而体温达到42℃后再复温病变进一步加重.结论 肺和脑对热打击和复温的病理改变表现出各自特征性改变,并且同复温的时机和时间有着一定的关系,此为理解中暑发生发展至多脏器功能障碍综合征(MODS)的发病机制提供了实验基础.
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热打击对人骨骼肌细胞通透性、细胞骨架及细胞周期的影响
目的 研究热打击对培养人骨骼肌细胞(HSKMC)通透性、细胞骨架及细胞周期影响.方法 流式细胞仪钙离子内流检测热打击对HSKMC细胞膜通透性的影响,考马斯亮蓝R-250染色法检测热打击对HSKMC细胞骨架影响,流式细胞仪检测热打击对HSKMC细胞周期改变.结果 给予培养人HSKMC细胞不同温度梯度热打击1h后,43℃热打击组钙离子流式检测的中位数为91.63,37℃对照组中位数为22.98.同对照组相比,随着热打击程度加强,显微镜高倍镜下可见骨骼肌细胞骨架逐渐出现变粗、变短、出现明显的应力纤维.骨骼肌细胞在热打击情况下,各组G0/G1期DNA含量在44.13～62.98之间,与正常对照组对比,当细胞离开热打击环境后培养18 h前G0/G1期DNA含量明显高于对照组,培养第18小时恢复才同对照组基本相同.结论 热打击的情况下造成细胞钙离子内流效应,导致细胞内钙超载.可改变HSKMC骨架结构,使骨架失去正常的网状有序排列结构,间隙增大.细胞周期出现阻滞,细胞被阻滞在G0/G1期.
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热打击对培养人脐静脉内皮细胞增殖能力的影响
目的:研究梯度热打击对体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响.方法:设置培养HUVEC细胞的温度梯度(39、41、43 ℃)进行热打击1 h,相差显微镜观察细胞形态学改变,CCK-8比较细胞增殖率,流式细胞术研究细胞周期改变.结果:与正常对照组比较,1 h热打击结束时,各热打击组均出现部分细胞形态变圆,伪足变短,细胞间隙增大,以43 ℃组为明显.随热打击程度加深,未伸展细胞占培养细胞百分比增加(P<0.05).细胞增殖实验显示,与正常对照组比较,热打击后24 h,41 ℃和43 ℃组增殖率显著下降(P<0.01),48 h时仅43 ℃组增殖率显著下降(P<0.05),至72 h,各热打击组与正常对照组无显著差异.流式细胞术检查显示,1 h热打击结束即刻,与正常对照组比较,各热打击组细胞呈现显著的G0/G1期阻滞,以43 ℃组显著(P<0.05);至48 h时各热打击组细胞周期基本恢复正常.结论:热打击对HUVEC具有细胞毒效应,可抑制HUVEC的增殖,造成细胞周期G0/G1期阻滞.
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蛋白酶活化受体1调控Mcl-1和Bax表达介导热打击致人脐静脉内皮细胞早期凋亡的研究
目的:观察热打击人脐静脉内皮细胞(HUVECs)后蛋白酶活化受体1(PAR1)对凋亡相关蛋白Mcl-1、Bax水平表达调控及细胞早期凋亡的影响,明确PAR1在热打击致HUVECs凋亡中的作用.方法:采用PAR1抑制剂SCH79797 (SCH)、PAR1激动剂TFLLR-NH2(TF)、PAR1 siRNA、PAR1腺病毒过表达预处理HUVECs,给予42℃热打击2h,后于8h提取各处理组总蛋白,western blot检测Mcl-1、Bax、Caspase 3及Cleaved-Caspase 3蛋白表达,流式细胞计数仪检测各处理组细胞早期凋亡.结果:与正常对照组比较,热打击组Mcl-1、Bax、Caspase 3表达增加及Cleaved-Caspase 3活化程度增加(P＜0.05);与热打击组比较,PAR1抑制剂或PARl siRNA联合热打击组Mcl-1表达增加(P＜0.05),Bax减少(P＜0.05),Cleaved-Caspase 3活化程度降低,细胞早期凋亡数目减少(P＜0.05,P＜0.01),PAR1激动剂或PAR1腺病毒联合热打击组Bax表达增加(P＜0.05),Mc1-1表达减少(P＜0.05),Cleaved-Caspase 3活化程度增加,且细胞早期凋亡数目增加(P＜0.05或P＜0.01).结论:热打击HUVECs可发生细胞凋亡,Mcl-1、Bax蛋白表达增加;PAR1通过调控Mcl-1及Bax的表达终起到促凋亡作用.
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热打击联合脂多糖刺激对人肠上皮细胞SW480释放细胞因子的影响
目的:观察脂多糖(LPS)与热打击分别单独作用与联合作用对人肠上皮细胞SW480释放细胞因子的影响.方法:于37℃、5％ CO2标准培养箱中培养人肠上皮细胞株SW480.实验分4组:空白对照组直接收集细胞上清；LPS单独刺激组(LPS组)分别使用0、0.01、0.1、1和10 μg/ml的LPS刺激SW480细胞,24 h后收集细胞上清；热打击组将SW480细胞进行热打击(42℃,1 h)后在标准孵箱分别培养1h和24 h后收集细胞上清；LPS+热打击组将SW480细胞42℃热打击1h后给予上述浓度的LPS刺激,再重新置于标准孵箱中培养,24 h后收集细胞上清.各组细胞上清用LiquiChip液相蛋白芯片系统分别检测粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等10种细胞因子/趋化因子的表达分泌水平.结果:单独LPS刺激时呈剂量依赖性诱导SW480表达分泌IL-8,对其余9种细胞因子/趋化因子的表达分泌水平影响不明显.单纯热打击仅诱导SW480细胞表达分泌IL-8的水平升高,且与空白对照组比较,仅热打击24 h后IL-8的水平显著增加(P＜0.01).热打击联合不同浓度的LPS刺激SW480细胞,LPS浓度低时并不影响SW480表达分泌IL-8的水平(P＞0.05),而高浓度LPS可以显著减少其表达分泌水平(P＜0.05).结论:人肠上皮细胞SW480作为脏器实质细胞,对炎性刺激仅能产生单一种类的细胞因子,其中LPS单独刺激和一定强度的热打击均可上调SW480分泌IL-8；但高浓度LPS在热环境下可抑制SW480细胞的IL-8表达分泌水平.
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热打击及中暑小鼠血清对小鼠肺微血管内皮细胞黏附单核细胞能力的影响
目的：研究热打击及10%中暑小鼠血清刺激肺微血管内皮细胞(PMVECs)对 PMVECs 表达血管内皮黏附分子(VCAM-1)和细胞间黏附分子(ICAM-1)水平及其黏附单核细胞能力的影响。方法：根据二次磁珠分选法分离乳鼠PMVECs,光镜下观察细胞形态并对其血管内皮细胞钙黏蛋白(VE-Cadherin)及Ⅷ因子进行染色鉴定。将PMVECs随机分为3组,分别进行37℃正常培养(对照组)、给予42℃2 h热打击或10%中暑小鼠血清刺激,24 h后分别提取总 RNA,荧光定量PCR及 Weston blot检测 VCAM-1及 ICAM-1mRNA和蛋白的表达水平,荧光显微镜观察其对人单核细胞(THP-1细胞)的黏附能力。结果：所分离 PMVECs 纯度较高,光镜下细胞呈特征性鹅卵石形状排列,VE-Cadherin及Ⅷ因子均可染色。与对照组相比,给予42℃2 h的热打击24 h后,VCAM-1及 ICAM-1的 mRNA 及蛋白水平表达降低(P<0.05),而给予10%中暑小鼠血清刺激24 h 后VCAM-1及ICAM-1的mRNA及蛋白水平表达增加(P<0.01)。与对照组相比,热打击组黏附THP-1细胞的细胞数无明显变化,中暑小鼠血清刺激组THP-1细胞数明显增多,显示PMVECs对单核细胞的黏附能力增强。结论：单独热打击并未使小鼠PMVECs黏附分子表达增加,而给予中暑小鼠血清刺激后其黏附分子表达显著上调,从而使单核细胞易于附壁,导致或加重了中暑相关的急性肺损伤。
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热打击对培养肠黏膜上皮细胞IEC-6细胞活性和增殖的影响
目的:研究梯度热打击对体外培养肠黏膜上皮细胞活性和增殖的影响.方法:肠黏膜上皮细胞株IEC-6经培养后分为正常对照组(37℃、5％CO2培养箱培养)及39℃、41℃、43℃热打击组(分别在相应温度培养箱中培养),相差显微镜观察各组细胞培养1h的形态学改变,CCK-8法比较各组细胞培养0、1、3、5、7h的细胞活性和24 h增殖率,流式细胞术研究细胞周期的改变.结果:与正常对照组比较,各热打击组各个时相细胞形态变圆,伪足变短,细胞间隙增大,活力下降(P＜0.01).24 h细胞增殖实验显示,与正常对照组比较,39℃组7h及41℃和43℃组各时相增殖率显著下降(P＜0.01),呈时间及温度依赖关系.流式细胞术检查显示,热打击组细胞呈现细胞周期G0/G1和G2/M期阻滞.结论:热打击对IEC-6细胞具有细胞毒效应,可抑制IEC-6细胞的增殖,造成细胞周期G0/G1和G2/M期阻滞.
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HSP27在热打击致F98细胞氧化应激损伤及细胞凋亡中的作用
目的 探讨热休克蛋白27(HSP27)在热打击(HS)致F98细胞氧化应激损伤及细胞凋亡中的作用.方法 以43℃热刺激60min建立F98细胞热打击模型,在热打击后的不同时间点(0、3、6、9、12h)收集细胞,Western blotting检测HSP27及其各丝氨酸位点的磷酸化水平;采用丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路抑制剂(SB203580、SP600125、PD98059)及腺病毒转染特异性抑制相关信号通路,探索F98细胞HSP27的信号调节途径;继而通过磷酸化位点抑制性突变腺病毒转染观察HSP27各位点磷酸化对F98细胞活力、活性氧(ROS)及凋亡水平等的影响.结果 给予热打击后,F98细胞HSP27在复温早期即轻度升高,其3个丝氨酸位点(Ser15,Ser78,Ser82)均发生磷酸化,以Ser78位点磷酸化为主.经MAPKs抑制剂预处理后,HS+SB203580组HSP27的3个位点磷酸化水平较对照组明显下降(P<0.05);MAPK激活蛋白激酶2(MK2)特异性抑制剂2'-氟-N-(4-羟基苯基)-[1,1'-联苯]-4-丁酰胺(CMPD-1)及腺病毒Ad-MK2(A)的干预,使HSP27丝氨酸位点磷酸化水平较HS组明显降低(P<0.05).将F98细胞分别转染HSP27磷酸化位点的抑制性突变腺病毒后,与HS组比较,Ad-Ser78-HSP27组细胞活力增强,ROS水平、Caspase-3活性及细胞凋亡率下降(P<0.05);而AdSer15-HSP27、AdSer82-HSP27组与HS组比较无明显差异(P>0.05).结论 p38 MAPK/MK2途径主要通过磷酸化HSP27的Ser78位点上调ROS,促进F98细胞凋亡.
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活性氧在热打击诱导肠上皮细胞凋亡中的作用
目的 观察热打击对大鼠肠上皮细胞(IEC-6)氧化应激反应、溶酶体损伤及细胞凋亡的影响,探讨中暑热损伤过程中肠道损伤的机制.方法 将IEC-6细胞分为对照组(细胞仅置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育)、热打击组(细胞置于43℃、5%CO2细胞培养箱中1h,之后分别置于正常细胞培养箱中继续孵育0、1、3、6、12h)、药物干预组(于热打击前分别采用溶酶体抑制剂E-64和活性氧清除剂NAC预处理细胞1h).采用DCFH-DA法检测细胞内活性氧(ROS)的表达,吖啶橙(AO)染色法检测溶酶体膜稳定性,AnnexinⅤFITC/PI双染色法检测细胞凋亡率,CCK-8法检测细胞活力.结果 与对照组比较,热打击后复温1h即导致IEC-6细胞活力下降,凋亡增加,且在复温后12h时为明显(P<0.05);热打击后即刻即引起细胞内ROS表达及"苍白细胞"数量增加,且在复温后12h时为明显(P<0.05).与热打击组比校,采用NAC对细胞进行预处理可明显提高热打击后细胞活力,减轻溶酶体损伤,并降低细胞凋亡率(P<0.05);采用E-64对细胞进行预处理可明显提高热打击后细胞活力,并降低细胞凋亡率(P<0.05).结论 ROS介导了热打击诱导肠上皮细胞凋亡的调控,这可能是中暑导致肠道黏膜屏障功能损伤的重要机制之一.
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热打击致大鼠肠上皮IEC-6细胞钙超载损伤的初步研究
目的 研究不同程度热打击对体外培养大鼠肠黏膜上皮细胞IEC-6的钙超载及钙超载相关的损伤.方法 设置培养IEC-6细胞的温度梯度,Fluo-3Am探针加荧光显微镜及流式细胞术观察细胞内钙离子水平的改变,相差显微镜观察细胞形态学改变,考马斯亮蓝染色法观察细胞骨架变化,CCK-8法观察细胞活性改变,黏附实验观察基底膜黏附性改变.结果 与正常对照组比较,热打击组细胞内钙水平上升(P＜0.01),呈温度依赖性.热打击组细胞形态变圆,伪足变短,细胞间隙增大,45℃较43℃改变更为明显.考马斯亮蓝染色显示,热打击组细胞骨架增粗、紊乱,出现应力性纤维,45℃较43℃改变更为明显.CCK-8法显示,热打击组细胞活性下降(p＜0.01),呈温度依赖性.基底膜黏附实验显示,热打击组基底膜黏附性显著下降(P＜0.01),呈温度依赖性.结论 热打击可造成IEC-6细胞钙超载,并造成与钙超载相关的一系列细胞损伤,热打击对于肠黏膜上皮钙超载的影响及其机制的进一步研究将有助于了解热射病的发病机制.
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梯度热打击对大鼠肝库普弗细胞吞噬功能的影响
目的 研究梯度热打击对体外培养大鼠肝库普弗细胞吞噬功能及分泌功能的影响.方法 设置培养库普弗细胞的热打击温度梯度(37、39、41、43℃),使用PI及Hochest33342染色细胞检测热打击后细胞受损情况,采用CCK-8法检测细胞增殖率,流式细胞术检测库普弗细胞对溶菌酶吞噬能力的改变.结果 与正常对照组相比,热打击各组均出现不同程度的细胞损伤,且随热打击程度加深而加重(P<0.05).细胞增殖实验显示,与正常对照组相比,热打击后6h,41℃和43℃组增殖率明显下降(P<0.01),12h时仅43℃组增殖率明显下降(P<0.001),至24h,各热打击组与正常对照组差异无统计学意义.流式细胞术显示,1h热打击结束后,与正常对照组相比,各热打击组细胞均呈现吞噬功能的下降,以43℃组为明显(P<0.05).结论 热打击可导致大鼠肝库普弗细胞吞噬功能受到抑制,可能与热打击对细胞的直接细胞毒作用有关.热打击对于肝库普弗细胞影响的进一步研究将有助于了解热射病的发病机制.
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谷氨酰胺对热打击下单层肠上皮Caco-2细胞屏障功能的影响
目的 探讨谷氨酰胺(Gln)对热打击后肠黏膜单层上皮细胞屏障通透性改变的影响及可能机制.方法 应用Caco-2细胞株建立肠上皮机械屏障模型,加入Gln培养24h,43℃持续1h热打击.以CCK-8法检测不同浓度Gln(0.4、0.7、1.4、2.1、2.8mmol/L)对细胞增殖的影响,为后续实验选择适合浓度;Transwell法测定单层跨膜电阻抗(TEER)值和对辣根过氧化物酶(HRP)的通透性;Western blotting检测紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达;采用考马斯亮蓝对细胞骨架进行染色观察.结果 0.7mmol/L的Gln促进细胞增殖的效果强,与其他浓度相比,差异均有统计学意义(P<0.05).相较于单纯43℃热打击组,0.7mmol/L的Gln可抑制单层上皮细胞TEER的下降和HRP通过率的升高(P<0.01),增加occludin和ZO-1的表达,有益于维持细胞骨架的正常结构.结论 0.7mmol/L的Gln可减轻热打击对单层肠上皮细胞结构的破坏,保护屏障功能.
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内质网应激和Ca2+超载在热打击诱导的肺微血管内皮细胞损伤中的作用与机制
目的 研究内质网应激和Ca2+超载在热打击诱导的肺微血管内皮细胞(PMVECs)损伤中的作用及其可能的机制.方法 建立PMVECs温度梯度热打击模型.对照组细胞始终置于标准37℃、5%CO2细胞培养箱孵育,热打击组细胞分别置于39、41、43℃细胞培养箱中热打击2h,热打击后继续在37℃、5%CO2细胞培养箱孵育6h;另取细胞在43℃热打击前分别以20μmol/L钙离子抑制剂BAPTA-AM和50μmol/L环孢霉素A(CsA)预处理,后续处理同43℃热打击组细胞.Western blotting检测磷酸化的蛋白激酶样内质网激酶(p-PERK)、磷酸化的真核生物翻译起始因子2α(p-eIF2α)、活性转录因子4(ATF4)以及葡萄糖调节蛋白78(GRP78)蛋白表达;流式检测细胞内Ca2+、线粒体膜电位以及线粒体通透性转换孔的变化;Caspase活性试剂盒检测caspase-3变化以反映细胞凋亡情况;Millicell-ERS细胞电阻仪测定细胞的跨上皮细胞电阻(TER)以了解细胞通透性的改变.结果 随着热打击温度的增高(41~43℃),PMVECs内p-PERK、p-eIF2α以及ATF4、GRP78蛋白表达增强,细胞内Ca2+水平增高,线粒体通透性转换孔开放,线粒体膜电位下降,细胞通透性增加,凋亡增多,且在43℃热打击组为明显,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).使用Ca2+抑制剂预处理细胞可以促使PMVECs线粒体通透性转换孔、膜电位以及细胞通透性恢复,减少凋亡的发生;使用线粒体保护剂预处理细胞并不能减轻PMVECs的Ca2+释放,但可促进细胞通透性恢复以及减少凋亡发生.结论 热打击可激活PMVECs的内质网应激反应,并诱导细胞内Ca2+超载介导的细胞和线粒体损伤,这可能是中暑导致内皮细胞损伤的重要机制之一.
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抗氧化剂对热打击人脐动脉血管平滑肌细胞收缩反应的影响
目的 研究抗氧化剂对热打击过程中人脐动脉血管平滑肌细胞(HUASMCs)收缩反应的影响.方法 将HUASMCs分为对照组、热打击组(HS组)和热打击前超氧化物歧化酶(SOD)预处理组(SOD+HS组),每组分别用低浓度NE(0.05mg/L)及常规浓度NE(1.0mg/L)刺激.各组细胞于41℃恒温水箱中分别培养0.5、1、1.5、2h后添加NE刺激,采用细胞表面积收缩比(%)反映细胞对NE的反应性.结果 与对照组比较,无论是给予低浓度或常规浓度NE刺激,HS组细胞热打击1h时对于NE的反应性均明显增高,2h时对于NE的反应性则明显降低(P<0.05或P<0.01);SOD+HS组细胞对NE的反应性在热打击至2h后均出现明显下降(P<0.05或P<0.01).对照组及HS组细胞对不同浓度NE刺激的反应性差异无统计学意义(P>0.05),SOD+HS组细胞在热打击过程中对常规浓度NE的反应性明显高于对低剂量NE的反应性(P<0.05或P<0.01).无论给予常规浓度或低浓度NE刺激,SOD+HS组细胞对NE的反应性均低于HS组(P<0.05或P<0.01).结论 热打击过程中,HUASMCs对NE的反应性呈时相性变化.抗氧化剂在中暑早期可能可以纠正HUASMCs对NE的过反应现象,但在热打击中后期,抗氧化剂并不能改善其反应性的下降.
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热打击对大鼠肺组织血管内皮生长因子A的影响
目的 研究热打击对大鼠肺组织血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factorA,VEGF-A)及相关细胞因子的影响.方法 雄性SD大鼠30只,随机分为空白对照组(n=10),热打击+恢复15min组(n=10),热打击+恢复3h组(n=10).热打击组大鼠麻醉后置于高温高湿模拟环境中,肛温达到42℃后置于室温分别恢复15 min及3h.酶联免疫法(Elisa)测各组大鼠肺组织匀浆VEGF-A及相关细胞因子水平.结果 热打击+恢复15 min组VEGF-A、转化生长因子β 1(transforming growth factor beta1,TGF-β1)水平较空白对照组显著升高,热打击+恢复3h组VEGF-A、TGF-β1水平较空白对照组显著降低,且VEGF-A水平与TGF-β 1水平呈直线回归关系.热打击+恢复3h组促炎细胞因子TNF-α水平略高于热打击+恢复15 min组和空白对照组.3组大鼠促炎细胞因子IL-6水平差异无统计学意义.结论 热打击早期大鼠肺组织VEGF-A水平短暂升高后,下降至正常水平以下,可能成为热打击后大鼠急性肺损伤发病初始阶段的重要环节,且该变化可能仅与热直接损伤有关.
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水浴降温与室温降温对热打击大鼠肺组织损伤及预后影响比较
目的：研究冰水浴、常温水浴、室温降温对热打击(heat stress，HS)大鼠死亡构成比、肺组织病理及相关细胞因子水平的影响。方法115只雄性SD大鼠随机分为肺损伤观察组(n=70)和死亡率分析组(n=45)。肺损伤观察组随机分为空白对照(normothermic contral，NC)组(n=10)和热打击(room temperature，RT)组(n=60)，NC组始终置于室温环境，HS组大鼠麻醉后置于高温高湿模拟环境，核心体温达42℃后，随机分为室温降温组(n=20)，常温水浴降温(temperate-water immersion， TWI)组(n=20)，冰水浴降温(ice water immersion，IWI)组(n=20)，分别给予相应降温方法降温。同时，将3组大鼠分别随机分为热打击后15 min处死组(n=10)和3 h处死组(n=10)。各组大鼠在相应时间点处死，HE染色观察肺组织病理改变， Elisa检测肺组织匀浆相关细胞因子水平。死亡率分析组随机分为HS + RT组、HS + TWI组、HS + IWI组，统计热打击后3 h死亡构成比。结果与HS + RT组相比，HS + TWI组和HS + IWI组大鼠死亡构成比显著降低(χ2=10.601，P=0.001)。HS + IWI 3 h组肺组织出现间质水肿、出血，肺泡萎缩塌陷、腔内出血，促炎因子TNF-α水平高于NC组(P＜0.05)及对应TWI组、RT组(P＜0.05)。结论 TWI、IWI较RT显著改善热打击大鼠预后，但IWI诱发更为严重的肺组织损伤，提示目前的水浴温度、水浴时长等可能不是优的。
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活性氧调控Bcl-2、Bax表达参与热打击后人脐静脉内皮细胞凋亡的研究
目的 观察热打击后人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内活性氧(ROS)爆发性增高调控Bcl-2、Bax表达对凋亡的影响,探讨重症中暑所致血管内皮损害的发病机制.方法 建立HUVEC热打击模型.将细胞分别置于39、41、43 ℃细胞培养箱中进行热打击2h,然后置于37 ℃、5％ CO2细胞培养箱后继续孵育24 h;在43 ℃热打击前以10μmol/L ROS特异性清除剂MnTMPyP预处理lh进行干预.对照细胞仅置于37 ℃、5％CO2细胞培养箱中孵育.应用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)法及二氢乙啶(DHE)法检测细胞内ROS表达;使用Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Bcl-2、Bax的mRNA表达;采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测Bcl-2、Bax及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的蛋白表达;同时检测MnTMPyP对热打击后细胞凋亡的影响.结果 与对照组比较,39℃热打击对细胞凋亡无影响,随着热打击温度增加至41℃、43℃时,细胞存活率呈进行性下降,ROS爆发性增加,Bax的mRNA和蛋白表达以及caspase-3蛋白表达显著增加,Bcl-2的mRNA和蛋白表达显著降低,且呈温度依赖性,其变化以43℃热打击为明显[细胞存活率:(46.00±4.00)％比(96.33±1.53)％,t=20.164,P=0.001;ROS(荧光相对值):400.67±12.10比99.33±4.04,t=32.909,P=0.001;Bax mRNA(A值):3.03±0.15比1.00±0.00,t=23.056,P=0.001;Bax蛋白(灰度值):3.97±0.21比1.00±0.00,t=24.684,P=0.001;caspase-3蛋白(灰度值):4.80±0.20比1.00±0.00,t=32.909,P=0.001;Bcl-2 mRNA(A值):0.42±0.30比1.00±0.00,t=33.072,P=0.001;Bcl-2蛋白(灰度值):0.39±0.25比1.00±0.00,t=42.212,P=0.001].MnTMPyP预处理可明显逆转43℃热打击对HUVEC的损害,可明显抑制Bax、caspase-3表达,上调Bcl-2表达[BaxmRNA(A值):2.00±0.20比3.33±0.25,t=7.184,P=0.002;Bax蛋白(灰度值):2.03±0.25比3.23±0.25,t=5.840,P=0.004;caspase-3蛋白(灰度值):2.07±0.21比5.00±0.20,t=17.600,P=0.001;Bcl-2 mRNA(A值):0.71±0.40比0.42±0.26,t=8.126,P=0.002; Bcl-2蛋白(灰度值):0.57±0.31比0.40±0.06,t=5.091,P=0.007].结论 热打击后HUVEC内ROS爆发性增高在凋亡中发挥了重要作用,其机制与调控凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达有关;血管内皮细胞凋亡可能是重症中暑的发病机制之一.
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热打击对体外培养人血管内皮细胞骨架及细胞周期的影响
目的：探讨热打击对体外培养人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）细胞骨架及细胞周期的影响。方法体外培养HUVEC，并分别置于37℃、5%CO2培养箱（对照组）或43℃细胞培养箱（热打击组）培养1 h。采用考马斯亮蓝R-250染色法，高倍镜下观察热打击对HUVEC细胞骨架的影响。热打击组细胞培养1 h后继续置于37℃、5%CO2培养箱孵育，分别于0、6、12、18、24 h采用流式细胞仪检测热打击对HUVEC细胞周期的影响。结果镜下观察对照组HUVEC细胞骨架形态正常；热打击组随热打击时间的延长，细胞骨架逐渐增粗、变短，且出现明显的应力纤维。对照组细胞G0/G1期DNA含量为48.57%，S期为44.62%，G2/M期为6.81%。在热打击后HUVEC细胞各时间点G0/G1期DNA含量为38.07%～55.19%，热打击后0、6、12、18、24 h组分别为54.06%、55.19%、48.23%、38.07%和41.03%；S期DNA含量为35.33%～48.18%，热打击后0、6、12、18、24 h组分别为35.33%、39.50%、42.50%、48.18%和47.99%；G2/M期DNA含量为5.31%～13.75%，热打击后0、6、12、18、24 h组分别为10.61%、5.31%、9.27%、13.75%和10.98%。说明当HUVEC细胞离开热打击环境后，G0/G1期DNA含量在6 h内明显高于对照组，至12 h时才恢复至对照组水平。结论热打击可改变HUVEC细胞骨架结构，且细胞周期出现阻滞，细胞被阻滞在G0/G1期。
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乌司他丁对热打击诱导人肠上皮细胞释放白细胞介素-8与p38信号通路的研究
目的 研究乌司他丁对热打击诱导人肠上皮细胞释放细胞因子的影响以及可能参与调控的信号通路.方法 用不同温度的热打击(39、41、43 ℃)1 h刺激培养的人肠上皮细胞株(SW480)后,继续于37 ℃下培养24 h,收集细胞和细胞上清液.另将细胞进行热打击(43 ℃,1 h),同时加用100 kU/L和1 000 kU/L的乌司他丁继续于37 ℃下培养24 h后收集细胞和细胞上清液;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清液中白细胞介素-8(IL-8)的含量,用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测细胞裂解液中p38蛋白表达.结果 低温度的热打击(39 ℃)对SW480细胞分泌IL-8没有诱导作用,但高温(41 ℃、43 ℃)可明显诱导IL-8水平的升高(均P<0.01);而乌司他丁可明显抑制热打击对SW480细胞IL-8的诱导表达作用(均P<0.01),尽管大剂量乌司他丁对IL-8的抑制作用较小剂量组更加明显,但两个剂量乌司他丁组间无明显差异.不同温度的热打击可诱导SW480细胞p38表达上调,并具有一定剂量依赖效应(均P<0.01).而乌司他丁不仅可以抑制SW480细胞p38的基础表达水平,并且小剂量的乌司他丁即可明显抑制热打击对p38的诱导表达作用(P<0.01),但两个剂量乌司他丁组间无明显差异.结论 乌司他丁可能通过降低p38表达来抑制热打击对肠上皮细胞释放IL-8的诱导作用,但同时也存在其他信号通路参与的可能,这为理解肠屏障细胞的炎症反应在重症中暑中肠道细菌和内毒素移位中的作用机制提供了一定的实验基础,也为乌司他丁作为免疫调节剂未来用于治疗重症中暑提供了实验依据.
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体外培养人肠上皮细胞株接受脂多糖联合热打击后白细胞介素6、肿瘤坏死因子a 的释放
背景：对于肠上皮细胞遭受高热和肠道细菌以及由细菌产生的内毒素等多重打击后经历了怎样的分子生物学变化，一直缺乏切实、可靠实验依据。
目的：观察脂多糖联合热打击对人肠上皮细胞损伤及炎症因子白细胞介素6、肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子a 释放的影响。
方法：体外培养人肠上皮细胞株(SW 480)，将3×105细胞种入实验用培养皿。实验分组为：对照组(37℃)，热打击组(43℃2 h)，脂多糖刺激组(1 mg /L脂多糖6 h)，热打击联合脂多糖刺激组(43℃+脂多糖)。采用WST-1法观察细胞毒效应和细胞存活率；同时采用ELISA法观察各组炎症因子白细胞介素6和肿瘤坏死因子a水平。
结果与结论：与对照组相比，热打击组具有细胞毒效应，其细胞活率明显下降，细胞炎症因子白细胞介素6和肿瘤坏死因子 a 水平也有所增高。脂多糖组单独作用也具有细胞毒效应，细胞活力、细胞增殖率也明显下降，同时白细胞介素6和肿瘤坏死因子a水平明显升高。而热打击和脂多糖联合打击后，可观察到两者的协同作用。结果说明，热打击和脂多糖单独作用均可引起细胞损伤，增加炎症因子白细胞介素6和肿瘤坏死因子 a 表达，并且二者之间存在协同效应。实验结果为理解重症中暑病理过程中，肠道功能障碍、肠道细菌和内毒素移位进而引发多脏器功能衰竭的病理机制提供了客观的实验依据。
