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热打击诱导氧化应激介导神经元凋亡过程中核因子κB的活化
组织构建；组织工程；热打击；神经元；细胞凋亡；核因子κB；活性氧；caspase-3；抗-核因子κB65蛋白；国家自然科学基金
背景：大量研究显示高热可诱导机体细胞发生广泛凋亡，但对于高热如何介导神经元细胞凋亡并没有深入研究报道。
目的：检测热打击细胞模型中核因子κB信号通路对活性氧诱导细胞凋亡的影响。方法：使用细胞培养箱建立细胞热打击模型，热打击组分别将细胞置于39，41，43℃培养箱中进行热打击2 h，对照组(37℃组)将细胞置于标准37℃、体积分数5%CO 2细胞培养箱。使用Annexin V-FITC/PI双染色方法检测不同温度热打击下神经元细胞凋亡率，Westen blot 检测caspase-3及抗-核因子КB65蛋白表达，DCFH法检测细胞内活性氧含量，同时检测活性氧抑制剂MnTMPyP及核因子κB抑制剂PDTC对热打击细胞凋亡的影响。
结果与结论：39℃热打击对细胞凋亡无影响，41℃热打击诱导细胞少量凋亡(10.19%)，43℃热打击诱导诱导细胞大量凋亡(43.02%)。caspase-3和抗-核因子κB65蛋白的表达于热打击温度依赖的方式增加。MnTMPyP及PDTC均可有效阻断热打击引起的caspase-3、抗-核因子κB65蛋白的表达和细胞凋亡。结果证实热打击后细胞内活性氧增加诱导神经元细胞凋亡，提示核因子κB可能作为中间信号通路参与了热打击引起的细胞凋亡。 -
乌司他丁对热打击肺泡巨噬细胞TREM-1表达和炎性分泌活性的影响
目的:探讨乌司他丁对热打击肺泡巨噬细胞TREM-1表达和炎性分泌活性的影响.方法:采集分离10例健康成年男性的肺泡巨噬细胞,分为对照组(Control组)、热打击组(HS组)、乌司他丁低剂量组(HS+LU组)和高剂量组(HS+HU组),每组10例,43℃、5％CO2条件下打击1h,复温培养6h,ELISA检测各组细胞培养上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1β和IL-6浓度,流式细胞仪检测细胞中活性氧簇(ROS)水平和细胞表面髓样细胞触发受体-1(TREM-1)表达.结果:HS组、HS+ LU组和HS+ HU组细胞培养上清中TNF-α、IL-1β和IL-6浓度均高于Control组(P＜0.05),而HS+ LU组和HS+HU组细胞培养上清中TNF-α、IL-1β和IL-6浓度均低于HS组(P＜0.05),其中HS+ HU组细胞培养上清中上述炎性递质浓度低于HS+LU组(P＜0.05).HS组、HS+LU组和HS+HU组细胞中ROS水平均高于Control组(P＜0.01),而HS+LU组和HS+ HU组细胞中ROS水平均低于HS组(P＜0.01),其中HS+ HU组细胞中ROS水平低于HS+LU组(P＜0.01).HS组和HS+LU组细胞表面TREM-1表达百分比高于Control组(P＜0.05),而HS+LU组和HS+ HU组细胞表面TREM-1表达百分比均低于HS组(P＜0.05),其中HS+HU细胞表面TREM-1表达百分比低于HS+LU组(P＜0.01).结论:热打击可诱导肺泡巨噬细胞TREM-1表达并促进炎性递质分泌,乌司他丁可缓解热打击肺巨噬细胞炎症反应的激活,其潜在机制与调控肺泡巨噬细胞TREM-1表达失衡有关,可能在重症中暑中发挥炎症反应调控作用.
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细胞凋亡在热打击致大鼠大脑皮质神经元损害中的作用及机制
目的 探讨热打击后大鼠大脑皮质神经元凋亡及easpase-3的表达变化.方法 将Wistar大鼠随机分为正常对照组和热打击组,正常对照组大鼠始终置于(25±0.5)℃,相对湿度(35±5)％环境下;热打击组置于人工智能气候舱内100 min,舱内温度(40±0.5)℃,相对湿度(60±5)％.TUNEL染色观察大鼠大脑皮质神经元的凋亡情况;免疫组织化学方法及荧光定量PCR检测大鼠大脑皮质神经元caspase-3的表达.结果 热打击1d后大脑皮质神经元出现凋亡,第3天达高峰.caspase-3于热打击2d后开始表达,于第3天表达明显.荧光定量PCR检测结果显示,caspase-3在1d、2d、3d和7d各时间点含量与正常对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),3d时caspase-3含量高.结论 热打击可激活caspase-3表达,诱导皮质神经元凋亡.
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和厚朴酚对热打击F98细胞的保护作用机制研究
目的 探讨和厚朴酚(HNK)对热打击F98细胞的保护作用机制.方法 建立F98细胞热打击模型,实验分为正常对照组、模型组(热打击组,HS组)、HNK组(10,20μmol·L-1)剂量组.采用CCK-8检测细胞活力、流式细胞仪分析ROS探针荧光强度、Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡,采用Western Blot检测丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)及其下游激酶MK2、PRAK磷酸化水平,分别给予MAPKs家族抑制剂、转染MK2及PRAK失活性腺病毒、不同剂量HNK预处理细胞,检测各组细胞ROS及细胞凋亡水平.结果 1.热打击可诱导F98细胞内ROS水平升高介导细胞凋亡,ROS具有促凋亡作用,经过HNK预处理的细胞ROS、细胞凋亡水平明显下降,以高剂量组作用更为明显(P<0.05).2.热打击可激活F98细胞内MAPKs家族的p-p38、p-ERK、p-JNK,并证实只有p38MAPK参与调节F98细胞内ROS累积并介导细胞凋亡,经过HNK预处理F98细胞后,可明显抑制p38、ERK的磷酸化水平,并可下调ROS及细胞凋亡水平.3.热打击可激活细胞内的p-MK2、p-PRAK,加入MAPKs家族抑制剂预处理后证实二者均为p38的下游激酶;加入HNK可显著抑制MK2及PRAK,给MK2特异性抑制剂CMPD-1及转染MK2、PRAK失活性腺病毒预处理细胞,结果表明,经过CMPD-1及转染MK2失活性腺病毒预处理的F98细胞的ROS水平及细胞凋亡水平明显下降,高剂量HNK可显著抑制平p38、MK2的磷酸化,明显降低热打击F98细胞的ROS及细胞凋亡水平.结论 HNK通过抑制p38/MK2路径下调ROS水平对热打击F98细胞发挥保护作用.
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核外P53介导的自噬抑制在热打击诱导内皮细胞损伤中的作用
目的 观察热打击主动脉内皮细胞(MAEC)后核外p53与细胞自噬和细胞凋亡之间的关系,阐明热打击后细胞死亡模式及其分子机制.方法 体外原代分离培养小鼠主动脉内皮原代细胞(MAEC),建立小鼠主动脉内皮细胞热打击模型,对照组将细胞置于标准37℃、5%CO2细胞培养箱,热打击组将细胞置于43℃细胞培养箱中进行热打击2 h,热打击后继续在细胞培养箱进行复温(0、1、3、6、9 h),并分别使用自噬抑制剂3-MA(5 mmol/L),自噬诱导剂rapamycin(20μmol/L),p53抑制剂PFT(10μmol/L)预处理细胞1 h,处理后的细胞通过CCK8法检测细胞活力以及Annexin V-FITC/PI双染色方法检测细胞凋亡率,JC-1染色流式观察细胞线粒体膜电位改变,细胞免疫荧光染色及Western blotting观察p53亚细胞定位和LC3-Ⅱ蛋白表达.结果 与对照组(37℃)比较,热打击后(43℃)MAEC细胞活力显著下降(P<0.05);热打击后复温6 h线粒体膜电位明显下降,同时细胞凋亡率显著增高(P<0.05);热打击后随着复温时间(0 h、6 h)延长,胞浆p53表达逐渐减弱,而线粒体p53表达逐渐增强;自噬抑制剂3-MA可进一步诱导细胞线粒体膜电位下降,并显著增高细胞凋亡率,而自噬诱导剂rapamycin可逆转上述损伤作用(P<0.05).p53抑制剂PFT明显促进了自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达,同时也明显抑制了热打击诱导的细胞线粒体膜电位降低和细胞凋亡(P<0.05).结论 热打击诱导MAEC细胞线粒体损伤及细胞凋亡,其机制与核外p53线粒体移位继而介导细胞自噬抑制有关.
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热打击联合脂多糖刺激对人肠上皮细胞损伤的作用
目的 探讨热打击联合脂多糖( LPS)刺激对人肠上皮细胞SW480损伤的生物学效应. 方法 体外培养SW480细胞,分为4组,对照组:将细胞置于37℃细胞培养箱中培养2 h;LPS刺激组:使用1 μg/mL LPS刺激细胞6 h;热打击组:将细胞置于43℃细胞孵箱中培养2 h;联合组:先将细胞置于43℃细胞孵箱中培养2 h,然后再用1 μg/mL LPS刺激6 h. 采用乳酸脱氢酶( LDH)法检测细胞毒效应,WST-1检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,通过检测TEER值评估细胞通透性,酶标仪检测Caspase-3酶活性,Westen blot 检测ZO-1蛋白的表达,DCFH-DA观察细胞内活性氧( ROS)水平. 同时采用ROS特异性清除剂MnTBAP预处理细胞,观察MnT-BAP对热打击联合LPS刺激诱导细胞损伤的影响. 结果 与对照组比较,热打击组及LPS刺激组LDH水平均显著升高(P<0.05),细胞存活率均显著降低(P<0.05);与热打击组及LPS刺激组比较,联合组LDH水平均显著升高(P<0.05),细胞存活率均显著降低(P<0.05). 与对照组比较,热打击组及LPS刺激组细胞凋亡率、Caspase-3表达量及ROS水平均显著升高(P<0.05),TEER值及ZO-1表达量均显著降低(P<0.05);与热打击组及LPS刺激组比较,联合组细胞凋亡率、Caspase-3表达量及ROS水平均显著升高(P<0.05),TEER值及ZO-1表达量均显著降低(P<0.05). 进一步研究发现由热打击联合LPS刺激诱导的上述损伤效应能够被MnTBAP逆转,从而减轻由热打击联合LPS刺激引起的细胞损伤. 结论 热打击和LPS之间存在协同效应,介导细胞损伤,在这一过程中ROS可能作为上游信号启动了这一损伤效应.
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Caspase-3在热打击诱导人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用
目的：探讨caspase-3活化对热打击诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响。方法：建立人脐静脉内皮细胞热打击模型，对照组将细胞置于标准37℃、5％CO2细胞培养箱，热打击组将细胞置于39℃、41℃、43℃细胞培养箱中进行热打击2 h，热打击后继续在细胞培养箱孵育24 h。使用Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡、Western blot 检测caspase-3蛋白表达、同时检测caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK对热打击组细胞凋亡的影响。结果：与对照组比较，39℃热打击对内皮细胞凋亡无影响，随着热打击温度的增加人脐静脉内皮细胞凋亡明显增多、caspase-3蛋白表达明显增加，caspase-3抑制剂 Z-DEVD-FMK 明显抑制了热打击诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡及 caspase-3蛋白的表达。结论： caspase-3介导了热打击诱导的人脐静脉细胞的凋亡。
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热打击对培养人骨骼肌细胞的损伤和释放IL-6、TNF-α的影响
目的:研究梯度热打击对体外培养骨骼肌细胞的损伤和表达IL-6、TNF-α的影响.方法:利用CCK-8法对比各组不同时相细胞存活率和24 h增殖率.采用ELISA法对比梯度热打击量对骨骼肌细胞释放IL-6和TNF-α的影响.结果:对比37℃对照组,热打击组各个时相细胞活力均下降(P＜0.001),并呈时间及温度依赖关系.对比37℃对照组,39℃组7h时段及41℃和43℃组各时相增殖率显著下降(P＜0.001),并呈时间及温度依赖关系.ELISA检查显示,热打击组IL-6和TNF-α的表达量较37℃对照组显著上升(P＜0.001),41℃和43℃组较39℃组显著上升(P＜0.01).结论:热打击对骨骼肌细胞具有细胞毒效应,抑制骨骼肌细胞的增殖,并促进细胞因子IL-6和TNF-α的释放.
