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羊瘙痒因子139A感染的小鼠脑组织中AMPK-ULK1自噬调节通路的研究
目的 研究感染羊瘙痒因子139A的小鼠脑组织中自噬的活化及其机制.方法 采用Western Blot方法检测感染羊瘙痒因子139A的小鼠终末期脑组织匀浆中的AMPK、ULK1及其磷酸化水平和LC3 Ⅱ的表达,并对其进行定量分析.结果 感染139A毒株的小鼠脑组织终末期脑组织中AMPK、ULK1及其磷酸化水平均表达升高.同时发现LC3 Ⅱ水平增加.结论 AMPK-ULK1通路在139A感染的小鼠脑组织中活化并且有可能对自噬的激活起到了重要的作用.
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新型棉酚衍生物对体外前列腺癌LNCaP细胞自噬影响的研究
目的:研究新型棉酚衍生物Apogossypolone(ApoG2)在体外对前列腺癌LNCaP细胞的自噬作用.方法:采用MTT、AO染色、透射电镜、流式细胞术和免疫组化方法,研究ApoG2对前列腺癌LNCaP细胞的生长抑制及诱导自噬的作用.结果:当ApoG2浓度＞2.5,μg/mL时,对前列腺癌LNCaP细胞有明显的增殖抑制,且有时间与剂量依赖性,ApoG2作用LNCaP细胞72 h时的IC50值为4.43 μg/mL.AO染色观察LNCaP细胞有自噬特征;透射电镜观察细胞内有自噬泡形成;流式细胞术检测细胞内出现大量酸性液泡细胞器(AVOs);免疫组化结果显示,ApoG2作用于LNCaP细胞后可以使细胞内Beclin 1的表达增高.结论:ApoG2在体外可以诱导前列腺癌LNCaP细胞的自噬,抑制前列腺癌LNCaP细胞的生长.
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自噬途径对反式-BPDE诱导人支气管上皮细胞16HBE影响及其机制的探讨
目的:研究反式-BPDE诱导正常的人支气管上皮细胞16HBE发生恶性转化前后自噬水平的变化及其可能机制.方法:利用前期建立的细胞恶性转化模型,采用激光共聚焦扫描显微镜成像技术,在无损伤状态下,实时观测反式-BPDE恶性转化细胞(16HBE-T)和正常细胞(16HBE-N)中自噬体标记蛋白GFP-LC3的荧光强度及定位,并利用蛋白质印迹法技术检测细胞内自噬信号通路关键效应分子的表达.结果:16HBE-T细胞与16HBE-N细胞相比,GFP- LC3蛋白的点状聚集明显减少,只有16HBE-N细胞的1/3左右,表明自噬水平下降,蛋白质印迹法检测发现,mTOR激酶活性上升,Beclin 1表达下降.结论:反式-BPDE可能通过自噬途径参与诱导16HBE细胞恶性转化的癌变过程,将为预防和治疗肺癌提供重要信息.
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突变型α-核突触蛋白的自噬性降解途径及可能机制
目的 观察突变型α-核突触蛋白对PC12细胞增殖的影响和可能的降解途径,探讨其在帕金森病发病机制中的作用.方法 对转染了α-核突触蛋白(A30P)的PC12细胞进行药物干预,检测细胞的增殖活性,并采用透射电镜观察细胞超微结构改变以及自噬的特征性改变,同时检测α-核突触蛋白的表达和超氧化物歧化酶(SOD)的水平.结果 (1)Western Blot法检测α-核突触蛋白的表达:A30P+渥曼青霉素组(A30P+W组)、A30P+1-甲基4-苯基吡啶组(A30P+MPP+组)较A30P组明显增高,以A30P+W组为明显;而A30P+雷帕霉素组(A30P+R组)条带较A30P组减低(P＜0.01);(2)不同时间点细胞培养液中SOD水平(U/ml)的测定:用MPP+处理转染了突变型α-核突触蛋白的PC12细胞后,培养液中SOD水平(A30P+MPP+组:3 h:97.49±13.8;12 h:102.7±12.7:24 h:101.5±11.8;48 h:104.3±12.4)较A30P组在各时间点显著下调(t=3.7721,P=0.0017);A30P+R组在给药12 h以后,培养液中SOD水平逐渐升高,其中在24 h(121.2±13.0)、48 h(124.3±14.1)和72 h(127.7±13.7)时与A30P+W组比较差异有统计学意义(t=2.9746,P=0.0083);突变型α-核突触蛋白激活了自噬途径,并介导了MPP+的毒性作用,自噬抑制剂渥曼青霉素可通过抑制自噬而加剧α-核突触蛋白积聚,导致细胞死亡;而自噬诱导剂雷帕霉素则可以通过诱导自噬的发生而促进α-核突触蛋白的降解和细胞生长.结论 α-核突触蛋白的异常积聚导致PC12细胞的自噬性细胞死亡,促进自噬有助于突变型α-核突触蛋白降解,对细胞具有保护作用.
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自噬在眼部疾病中的研究进展
自噬是细胞对不良环境的一种自我防御机制,真核细胞通过自噬清除异常积聚的蛋白和损伤的或多余的细胞器,甚至病原微生物来维持细胞内稳态.近年来的研究表明,自噬与众多眼病包括白内障、角膜营养不良、青光眼、年龄相关性黄斑病变等疾病的发生和发展有着密切联系.期望通过小分子化合物(自噬的激活剂或抑制剂)或者药物调控细胞的自噬水平,从而为眼部疾病提供一种新的治疗策略.
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西罗莫司对鱼藤酮诱导PC12细胞凋亡的抑制作用
目的 观察西罗莫司干预鱼藤酮诱导PC12细胞凋亡的作用,以探讨西罗莫司用于治疗帕金森病的可能性及机制.方法 PC12细胞处理分为正常对照组、鱼藤酮50 nmol·L-1组和西罗莫司25,50,100和200 μg·L-1组.PCI2细胞加入西罗莫司25,50,100和200 μg·L-1预处理12 h后,再加入鱼藤酮50nmol·L-1作用24 h.采用4',6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)免疫荧光实验检测细胞凋亡形态变化;Annexin V-FTTC/PI染色法检测细胞凋亡率;罗丹明123检测线粒体膜电位;吖啶橙荧光染色法检测自吞噬体形成;Westem印迹法检测胱天蛋白酶3和微管相关蛋白轻链3(LC3)表达.结果 与鱼藤酮模型组比较,西罗莫司50,100和200 μg·L-1组细胞凋亡率分别降低了20.6%,35.4%和40.2%(P
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组蛋白脱乙酰基酶6在聚集小体和神经变性疾病中的作用
组蛋白脱乙酰基酶6(HDAC6)是主要存在于胞浆中的微管脱乙酰基酶,在体内参与多种重要的生物学过程.研究表明,错误折叠和聚集的蛋白质组成的聚集小体是神经变性疾病的主要病理特征, 聚集小体在早期通过自吞噬作用,对细胞起着保护性作用, 而HDAC6能调节聚集小体的形成并且参与自噬性降解.本文综述了近几年HDAC6参与聚集小体以及神经变性疾病发生发展的研究进展,为神经变性疾病的治疗提供新的研究思路,并为新药研发提供更多的理论依据.
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辐射诱导人骨髓间充质干细胞自噬反应的研究
目的 观察辐射条件下人骨髓间充质干细胞(hBMMSC)的自噬反应。方法 应用Annexin- Ⅴ/PI双标法检测0、2、4、8、10Gy X线照射后4 h hBMMSC凋亡率和坏死率的变化;通过透射电子显微镜观察0、8、10Gy X线照射后4h的hBMMSC自噬形态学变化，以经典的自噬诱导剂雷帕霉素处理组作为阳性对照，并应用RT-PCR技术检测自噬相关基因Beclin1和微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAPLC3，简称为LC3)mRNA表达。结果 在低于8 Gy的剂量范围内，hBMMSC的凋亡率随照射剂量的增加而降低，坏死率和死亡(凋亡+坏死)率随照射剂量的增加而升高，但升高幅度较小。当剂量增至10 Gy时，凋亡率升至高，而坏死率和死亡率的升高幅度增大。并且整体凋亡率变化比坏死率明显。透射电镜观察显示正常对照组中偶见自噬泡(自噬体和自噬溶酶体合称为自噬泡)出现，而照射组及阳性对照组中均可见明显自噬泡聚集，8 Gy照射组的自噬泡阳性细胞比例为(71.67 +7.64)％，高于10 Gy照射组的(56.67±7.64)％。RT-PCR检测结果显示正常对照组中Beclin1 mRNA和LC3 mRNA表达水平均很低，而照射组及阳性对照组中两个基因的表达明显升高，且8 Gy照射组(0.518±0.005、0.408±0.006)表达水平高于10 G照射组(0.441±0.002、0.360±0.019)％。结论 辐射应激可以诱导hBMMSC的自噬反应，在一定照射剂量范围内，自噬可能对hBMMSC有放射保护作用。
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FTY720诱导多发性骨髓瘤细胞株U266自噬与凋亡的研究
目的 探讨新型免疫抑制剂FTY720对多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡及自噬的影响,并探讨相关的作用机制.方法 0、2.5、5.0、10.0及20.0μmol/L FTY720处理U266细胞24h后,应用CCK-8方法检测不同浓度FTY720对U266细胞生存率的影响；20.0μmol/L FTY720分别处理细胞0、2、6及24h,通过CCK-8方法检测FTY720作用不同时间对U266细胞生存率的影响.同时应用流式细胞术Annexin Ⅴ-FITC/PI染色检测相应的细胞凋亡率.不同浓度FTY720处理U266细胞后,应用Western blot法检测微管相关蛋白轻链3(LC3)B的表达,明确应用FTY720后是否引起细胞发生自噬.FTY720单用或联合应用自噬抑制剂Bafilomycin A1处理U266细胞24h,检测细胞生存率及凋亡率,并检测其对抗凋亡因子survivin表达的影响.结果 应用FTY720后,U266细胞生存明显受抑制,可引起细胞发生凋亡,作用呈浓度及时间依赖性.LC3B-Ⅱ表达明显增加,呈浓度依赖性,表明FTY720可引起细胞发生自噬.应用自噬抑制剂Bafilomycin A1后,可解救FTY720引起的细胞生存抑制及凋亡,同时可解救FTY720引起的survivin表达下降.结论 FTY720可引起U266细胞发生凋亡及自噬,自噬对凋亡具有促进作用.其机制可能为通过自噬在溶酶体降解了survivin等抗凋亡因子或其上游调控因子,从而促进细胞凋亡.
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丙戊酸诱导胶质瘤细胞自噬及其机制研究
目的 对丙戊酸诱导胶质瘤细胞发生自噬性死亡的过程进行观察,并初步探讨其可能的机制.方法丙戊酸处理人脑胶质瘤细胞系U87、T98G和SF295,台盼蓝染色检测细胞活性并计算细胞存活率;流式细胞仪测定细胞周期.透射电子显微镜和荧光测定仪观察细胞超微结构及自噬水平,West.ern blotting检测经丙戊酸处理后细胞内LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-Akt和p-p70S6K等蛋白质的表达水平.结果 经不同浓度丙戊酸处理后,人脑胶质瘤细胞系U87、T98G和SF295细胞活性明显受到抑制,其胶质瘤细胞半数抑制浓度分别为(2.45±0.32)、(4.78±0.62)和(6.62±0.95)mmol/L,其中丙戊酸对人脑胶质瘤细胞系U87具有较明显的杀伤作用(P＜0.05).透射电子显微镜观察可见人脑胶质瘤细胞系U87细胞胞质内有大量自噬体和自噬溶酶体,其自噬水平随丙戊酸浓度的升高而逐渐增强.经丙戊酸处理后,人脑胶质瘤细胞系U87细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表达水平明显升高,而p-Akt和p-p70S6K表达水平明显降低.结论 丙戊酸可诱导胶质瘤细胞发生自噬,其诱导胶质瘤细胞发生自噬的机制可能与阻断Akt信号转导通路有关.
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大鼠坐骨神经再生过程中许旺氏细胞的自噬作用
背景 :Wallerian变性时髓鞘溃变碎片的清除对于神经的再生至关重要 ,但溃变碎片的清除机制一直没有彻底阐明 ,关于参与清除的细胞成分类型仍有很大争议. 目的 :探讨大鼠坐骨神经再生过程中许旺氏细胞的自噬作用. 设计 :完全随机自身对照研究. 地点和对象 :本实验由第一军医大学解剖教研室、汕头大学医学院中心实验室和西南大学达拉斯医学中心精神病学部共同完成 ,研究对象为成年 Wistar大鼠 30只 ,雌雄各半 ,体质量 180- 250 g. 干预 :横切大鼠坐骨神经制作 Wallerian变性模型 ,分别于造模后 0,0.5,1,1.5,2,3,4,5,7,10,15 d取远断端组织行电镜观察. 主要观察指标 :电镜观察轴突和髓鞘的超微结构 ,Gomori染色后检查酸性磷酸酶活性. 结果 :轴突在第 0.5天时从髓鞘脱离,溃变呈空泡状.第 2天开始髓鞘皱褶、断裂形成碎片,许旺氏细胞内见大的膜结合髓鞘碎片和许多散在小碎片,并与溶酶体融合形成自噬泡,呈酸性磷酸酶 (AcPase)阳性.第 4天时内膜区偶见幼稚细胞 ,1周后见大量幼稚细胞.第 7天后许旺氏细胞内自噬泡数量开始减少.实验全程偶见巨噬细胞 ,内有吞噬泡. 结论 :大鼠坐骨神经再生过程中溃变髓鞘主要经许旺氏细胞自噬清除,许旺氏细胞脱分化为许旺氏细胞祖细胞后大量增殖分化参与神经再生过程.
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基质窖蛋白-1在食管鳞癌中的表达及与自噬的关系
目的 探讨基质窖蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)在人食管鳞癌组织中的表达以及与自噬标志物——微管相关蛋白轻链3B(microtubule associated protein light chain 3B,MAP-LC3B,简称LC3B)的关系及其临床病理意义.方法 利用量子点免疫荧光组织化学技术检测基质Cav-1和LC3B蛋白在76例食管鳞癌组织和15例非癌变食管黏膜上皮组织中的表达.结果 基质Cav-1和LC3B蛋白在食管鳞癌组织的阳性表达率分别为28.9％和64.5％,与非癌变食管黏膜上皮组织比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).基质Cav-1的阳性表达与食管鳞癌TNM分期和淋巴结转移均显著相关(P＜0.05),而与其他临床病理参数均无关(P＞0.05).LC3B与肿瘤浸润范围、TNM分期和淋巴结转移均显著相关(P＜0.05).基质Cav-1和LC3B蛋白在食管鳞癌中的表达呈正相关(r=0.353,P=0.002),二者缺失表达能更好地预示淋巴结的转移.结论 基质Cav-1和LC3B表达缺失可协同促进食管鳞癌的形成和恶性进展.
关键词： 食管肿瘤/病理学 量子点 Caveolin-1 自吞噬作用 -
紫杉醇诱导子宫颈癌HeLa细胞自噬性凋亡的观察
目的 观察紫杉醇对体外培养的子宫颈癌HeLa细胞自噬性凋亡的影响,并初步探讨其可能的机制.方法 不同浓度(1.2、6、12、24、36 mg/L)的紫杉醇处理体外子宫颈癌HeLa细胞6、12、24、48、72小时后,用MTT法测定其生长抑制率,倒置显微镜及透视电镜观察细胞形态学变化,通过流式细胞术分别测定细胞凋亡率、细胞周期分布,RT-PCR检测自噬基因Beclin 1表达的变化情况.结果 紫杉醇呈剂量和时间依赖性抑制子宫颈癌HeLa细胞增殖;紫杉醇12 mg/L处理的HeLa细胞,早期(24小时内)可出现明显的细胞自噬性变化,细胞凋亡数明显增加,G2/M期阻滞,且自噬基因Beclin 1的表达明显增高.结论 紫杉醇具有抑制子宫颈癌HeLa细胞增殖、诱导细胞自噬性凋亡等作用,诱导子宫颈癌HeLa细胞发生自噬性凋亡,其机制可能与上调自噬基因Beclin 1的表达水平有关.
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子宫内膜癌发生过程中自噬活性改变的初步探讨
目的:探讨正常子宫内膜、子宫内膜增生以及子宫内膜腺癌中自噬活性的变化.方法:收集2004年1月至2005年3月行子宫切除或诊断性刮宫的组织标本135例,其中正常子宫内膜43例,子宫内膜单纯性增生及复合性增生27例,子宫内膜不典型增生26例,子宫内膜腺癌39例.用免疫组化法检测全部组织中的Cathepsin-D和Rab7的表达.结果:(1)Cathepsin-D表达在正常子宫内膜增生期明显高于分泌期(0.244±0.091 vs 0.141±0.071,P<0.05);Rab7表达呈同一趋势(0.197±0.084 vs 0.114±0.060,P<0.05);(2)子宫内膜单纯性、复合性增生组的Cathepsin-D表达明显高于子宫内膜不典型增生组,子宫内膜腺癌细胞中Cathepsin-D表达则明显减弱(0.561±0.168 vs0.311±0.089 vs 0.055±0.044,P<0.001);Rab7的表达呈现与Cathepsin-D同一趋势(0.508±0.152 vs 0.281±0.076 vs 0.026±0.019,P<0.001).结论:正常增生期子宫内膜细胞的自噬活性比分泌期子宫内膜细胞明显增强,子宫内膜增生的自噬活性比正常子宫内膜强,而子宫内膜腺癌细胞自噬活性明显减弱,提示自噬活性的改变可能参与了子宫内膜样腺癌的发生.
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依达拉奉对帕金森病小鼠模型中脑细胞自噬的影响
目的 探讨依达拉奉对帕金森病(PD)小鼠脑细胞自噬的影响.方法 随机将30只健康雄性C57BL/6小鼠,分为正常对照组、模型组、治疗组各10只.后两组给予腹腔注射百草枯10 mg/kg、代森锰30 mg/kg,每周二、四各1次,连续6周.建模成功后治疗组给予依达拉奉3 mg/kg腹腔注射2周,正常对照组给予等量生理盐水.观察3组小鼠行为学的改变、并用Western blot法检测中脑自噬特异性标记物LC3Ⅱ、beclin 1的表达.结果 与治疗组比较,模型组悬挂时间明显缩短,中脑LC3Ⅱ、beclin 1的表达显著增高.结论 依达拉奉治疗可显著抑制PD小鼠模型脑细胞自噬.
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肝癌细胞自噬性凋亡过程中caspase-3基因的克隆与鉴定
目的从长春新碱诱导发生自噬性凋亡的肝癌细胞系HepG2中克隆caspase-3基因.方法提取细胞总RNA,采用RT-PCR技术扩增目的片段,构建重组克隆载体,测序鉴定及分析.结果经RT-PCR获得了预期的扩增产物即caspase-3基因625bp的核苷酸片段,其测序结果与文献报道一致.结论初步证明该caspase-3基因片段参与了长春新碱诱导的HepG2细胞自噬性凋亡过程.
关键词： HepG2肝癌细胞系 自吞噬作用 细胞凋亡 长春新碱 caspase-3基因 -
细胞自噬与肿瘤
自噬又称为II型程序性细胞死亡(type II programed cell death)是以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬体为特征的细胞"自我消化"的一系列生化过程~([1]).自噬现象早是Ashford和Porter于1962年用电子显微镜在人的肝细胞中观察到.近年来随着酵母模型的建立,分子生物学及基因技术的发展,对自噬的研究有了很大的进展.
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自噬与心肌缺血/再灌注损伤
自噬现象早是于1962年在电子显微镜下被观察到的,它是细胞内的物质成分利用溶酶体被降解过程的统称,是真核细胞所特有的,主要负责长寿命蛋白以及细胞器的降解和再利用.在正常生理情况下它在清除无用的、多余的、受损的或癌变的细胞器,维持机体内环境稳态方面发挥重要作用.在病理情况下它也起了重要的作用,过去的研究发现自噬和心肌缺血/再灌注关系密切,现就自噬和它在心肌缺血/再灌注损伤中的作用、信号转导、研究现状做一综述.
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脑损伤中的自噬现象
自噬(autophagy)是细胞的一种高度保守降解途径,其将细胞内无用的大分子(如长寿命蛋白质、细胞器等)运送至溶酶体,降解成有生物活性的小分子,并将这些小分子重新利用,以维持细胞内环境稳定.脑损伤早期,神经元和星形胶质细胞的自噬作用明显增强.本文对自噬的定义、分类、形态学特征、分子基础、检测及与脑损伤的相关进展等进行概述,为临床治疗脑损伤提供理论基础.
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PM 2．5对大鼠气管上皮细胞氧化应激及自噬的影响
目的：探讨 PM2．5对 RTE 大鼠气管上皮细胞的氧化应激及自噬的影响。方法：采集制备不同浓度的 PM2．5来处理 RTE 细胞，用 MTT 比色法测定细胞增值率，流式细胞术检测细胞内活性氧类（ROS）自由基生成，Western Blot 检测微管相关蛋白1轻链3 I 蛋白（LC3I）和 LC3II 表达。结果：PM2．5100 mg／L 和200 mg／L 处理后细胞存活率均明显降低，并呈浓度和时间依赖性。不同浓度PM2．5可升高胞内 ROS 水平及增加 LC3 II 蛋白表达，亦呈浓度和时间依赖性。结论：PM2．5通过诱发氧化应激及自噬对气道上皮起到损害作用，其中氧化应激促进细胞过度自噬的发生。
