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重型β地中海贫血γ珠蛋白基因启动子区甲基化状态
本研究旨在通过对广西省重型β地中海贫血患者和正常人外周血中γ珠蛋白基因启动子区CpG岛的甲基化位点的确认和对各个CPC位点甲基化率在重型β地中海贫血患者与正常人之间的差异性分析,初步筛选出可能影响γ珠蛋白表达的主要甲基化位点.采用重亚硫酸盐测序法修饰,递降PCR扩增,后对PCR产物进行DNA克隆测序,得到目的片段中每个CG位点的甲基化情况,定量检测甲基化的确切位置与程度.结果表明:重型β地中海贫血患者与正常人γ珠蛋白基因启动子区存在4个CpC甲基化位点,在序列中分别位于28、122、231和234bp,均呈高度甲基化,其中122和231 bp位点甲基化率明显低于正常对照组,差异均有统计学意义.28和234 bp位点甲基化率与正常对照组均无显著性差异.结论:证实γ基因启动子区存在甲基化位点、明确位点位置且经定量分析证实无论地中海贫血患者还是正常人各个甲基化位点均呈高甲基化状态；初步筛选出影响γ珠蛋白表达的主要位点可能在122和231 bp,为后续通过调节γ珠蛋白的表达缓解重型β地中海贫血的临床症状、靶向基因治疗研究提供了实验依据.
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西罗莫司诱导K562细胞γ珠蛋白基因表达机制探讨
目的 探讨西罗莫司诱导K562细胞γ珠蛋白基因表达的作用机制.方法 终浓度10 nmol·L-1西罗莫司处理K562细胞3d,同时设立阳性药物(丁酸钠)对照、二甲基亚砜对照和空白对照.采用Western blot方法检测p38MAPK.采用基于Realtime PCR的染色质免疫共沉淀方法分析γ珠蛋白基因启动子乙酰化组蛋白H3水平.结果 经西罗莫司处理的K562细胞的磷酸化p38MAPK相对水平及γ珠蛋白基因启动子乙酰化组蛋白H3水平分别比空白对照细胞升高2.8和9.8倍、分别比二甲基亚砜处理组升高2.9和9.1倍,而与丁酸钠处理的细胞无显著性差别.SB203580预处理K562细胞可中止西罗莫司升高磷酸化p38MAPK及γ珠蛋白基因启动子乙酰化组蛋白H3的作用.结论 西罗莫司诱导K562细胞γ珠蛋白基因表达的机制与其激活p38MAPK信号和上调启动子乙酰化组蛋白H3有关.
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黄芪多糖对K562细胞胎儿血红蛋白合成和细胞增殖的影响
目的 探讨黄芪多糖(APS)对K562细胞胎儿血红蛋白(HbF)合成和细胞增殖的影响.方法 以K562细胞为模型,不同质量浓度APS(150、300、450 mg/L)诱导的细胞为实验组,丁酸钠(NaB)诱导的细胞为阳性对照,分别用 Western blot和锥虫蓝拒染法计数分析HbF表达水平和对K562细胞增殖的影响.结果 1.剂量效应:150、300和450 mg/L APS分别诱导K562细胞48 h,HbF合成增强(F=310.476 P=0),分别增加至未加药组的(1.56±0.03)、(1.78±0.04)和(1.51±0.32)倍,诱导前后有显著性差异.300 mg/L APS组诱导时HbF合成强(P=0.005).2.时间效应:300 mg/L APS诱导K562细胞后HbF合成逐渐增加,峰值在48～60 h,为未加药组的(2.10±0.19)倍 (P=0),以后逐渐下降.与NaB组[(2.88±0.27)倍]比较, APS 诱导K562细胞HbF合成有显著性差异(P=0).3.APS对K562细胞的增殖作用:不同质量浓度(150、300和450 mg/L )APS和0.5 mmol/L NaB对K562细胞生长的影响不同(F=297.078 P=0).APS的抑制作用随质量浓度升高而增强,但均弱于NaB(P=0.001).APS和NaB各诱导K562细胞48 h抑制率分别为20.45%和79.55%,有显著性差异(P=0);诱导72 h抑制率分别为38.46%和90.11%,有显著性差异(P=0).结论 APS可诱导K562细胞HbF合成增加,其对K562细胞增殖的抑制作用较NaB弱.
关键词： β-珠蛋白生成障碍性贫血 K562细胞 γ珠蛋白基因 黄芪多糖 -
苦参碱上调K562细胞γ珠蛋白 mRNA表达和诱导红系分化
目的 研究苦参碱对K562细胞γ珠蛋白 mRNA表达及红系分化作用.方法 不同水平苦参碱诱导K562细胞 6 d,应用台盼蓝拒染试验细胞计数、联苯胺染色、Wright-Gimesa 染色进行红系分化的研究,同时应用荧光定量 RT-PCR技术来相对定量研究药物诱导后Gγ、Aγ珠蛋白基因 mRNA 表达水平的变化.结果 K562 细胞增殖抑制程度随苦参碱水平增大而增加,联苯胺染色阳性细胞数由未诱导时的 0.7%高可上升至 15.7%,且在形态上出现向红系分化的特征,同时伴有Gγ珠蛋白 mRNA表达增加.结论 苦参碱可引起K562细胞增殖抑制,在诱导其向红系方向分化中伴有Gγ珠蛋白 mRNA表达被上调,为药物诱导治疗β珠蛋白基因缺陷性疾病提供实验依据.
关键词： 苦参碱 红系分化 γ珠蛋白基因 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应 -
丁酸钠对K562细胞系γ珠蛋白基因表达的诱导作用及机制
目的:研究丁酸钠对K562细胞系γ珠蛋白基因表达和胎儿血红蛋白合成的诱导作用及机制.方法:以丁酸钠(0.5 mmoL/L)诱导72 h的K562细胞为实验组,设K562亲本细胞和SB203580(10 μmol/L)处理1 h后用丁酸钠(0.5 mmoL/L)诱导72 h 的K562细胞为阴性对照组,设羟基脲(100 μmol/L)诱导72 h的K562细胞为阳性对照.分别提取细胞总RNA 和总蛋白.采用RT-PCR、Western blotting和联苯胺染色方法检测γ珠蛋白基因、胎儿血红蛋白和p38表达及p38磷酸化水平.结果:与K562亲本细胞和SB203580处理后丁酸钠诱导的K562细胞相比,丁酸钠诱导的K562细胞中G-γ珠蛋白、A-γ珠蛋白和胎儿血红蛋白的表达均明显上调(P<0.05),p38 mRNA和蛋白水平表达均无明显变化(P>0.05),但p38蛋白磷酸化水平显著增加(P<0.05).K562亲本细胞、SB203580处理后丁酸钠诱导的K562细胞和丁酸钠诱导的K562细胞中联苯胺阳性细胞百分率分别为(3.2±0.4)%、(12.7±0.2)%和(36.3±0.8)%(P<0.05).结论:丁酸钠可以诱导K562细胞高表达γ珠蛋白基因、合成胎儿血红蛋白,p38MAPKs的激活在丁酸钠诱导K562细胞高表达γ珠蛋白基因中发挥重要作用.
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补肾益髓法对地中海贫血患者β-珠蛋白及BCL11A基因表达的影响
目的:探讨补肾益髓法对地中海贫血患者β-珠蛋白基因的调控作用及B细胞淋巴瘤11A蛋白(B-cell lymphoma 11A,BCL 11A)基因表达影响.方法:将82例患者随机分为对照组和治疗组,每组41例.对照组口服羟基脲片治疗,每日25 mg· kg-1,每周2次,6周为1个疗程,连续治疗2个疗程.治疗组:在对照组的治疗基础上,配合应用补肾益髓法治疗,方药组成:山萸肉、何首乌、熟地黄、补骨脂、黄芪、鳖甲、甘草.各每袋10 g,生药量相当于2.27 g中药原材,由中国中医科学院广安门医院大兴制剂中心生产,每日1袋,每日3次,温开水冲服,连续治疗3个月.观察两组患者治疗前后血常规、β珠蛋白基因mRNA(β-mRNA)、γ珠蛋白基因mRNA (γ-mRNA)、BCL 11A水平变化情况,并比较两组患者的临床疗效.结果:与治疗前比较,两组患者血红蛋白(hemoglobin,Hb)、红细胞总数(red blood cel,RBC)、网织红细胞(reticulocyte,Ret)、红细胞正均体积(erythrocyte mean corpuscular,MCV)、γ-mRNA及γ/(γ+β) mRNA水平均较治疗前明显升高,差异有统计学意义(P ＜0.05);BCL 11A及中医证候评分均较治疗前明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);与对照组比较,治疗组患者治疗后Hb、RBC、Ret、MCV、γ mRNA、γ/(γ+β)mRNA表达水平改善情况及治疗有效率高于对照组,差异有统计学意义(P ＜0.05);BCL 11A水平及中医证候评分均低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),两组之间及治疗前后β-mRNA水平比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);两组不良反应比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:补肾益髓法能有效降低地中海贫血患者BCL11A表达水平,提高Hb、WBC、Ret和γ-mRNA表达水平,具有较好的临床疗效,安全性良好,但对β-mRNA水平无明显影响,其具体作用机制有待于进一步研究.
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黄芪多糖诱导K562细胞γ-珠蛋白基因表达
目的 探讨黄芪多糖(APS)对K562细胞γ-珠蛋白基因表达的诱导作用.方法 以K562细胞为模型,以APS诱导的细胞为实验组,未加药细胞为空白对照,丁酸钠(NaB)处理的细胞为阳性对照,分别用联苯胺染色和RT-PCR分析联苯胺染色阳性率、Aγ-和Gγ-珠蛋白基因mRNA表达水平.结果 (1)与空白对照组相比,300 mg/L APS诱导48 h后联苯胺染色阳性率由(4.37±0.58)%升高至(15.67+1.80)%(P<0.05).300 mg/L APS诱导K562细胞48 h的联苯胺染色阳性细胞总数为(60.40±6.33)×102.与NaB组(42.02±16.42)×102相比差异有显著性意义(P<0.05).(2)与空白对照组相比,300 mg/L APS诱导48 hAγ和Gγ珠蛋白基因tuRNA表达分别增加3.59±0.16倍和5.02±0.81倍(P=0.000).结论 APS可诱导K562细胞Aγ和Gγ珠蛋白基因mRNA表达增强,具有治疗β-珠蛋白生成障碍性贫血的潜能.
关键词： 黄芪多糖 β-珠蛋白生成障碍性贫血 K562细胞 γ珠蛋白基因 丁酸钠 -
低剂量羟基脲联合丁酸钠对K562细胞γ珠蛋白基因表达的作用
目的:探讨低剂量羟基脲(hydroxyurea,HU)与丁酸钠(sodium butyrate,NaB)联合诱导人白血病细胞株(K562)细胞对γ珠蛋白基因表达的作用.方法:以K562细胞株为研究对象,用不同浓度HU和/或NaB作用于K562细胞,台盼蓝拒染活细胞计数观察细胞生长;联苯胺染色了解细胞红系分化,RT-PCR测定珠蛋白基因γ-mRNA表达.结果:25 μmol/L HU与100 μmol/L NaB是佳用药组合,其对细胞生长抑制率为(46.09±1.54)%,与HU100 μmol/L(64.31±5.19)%、NaB 500 μmol/L(86.25±1.10)%比较差异有显著性(P<0.05);联苯胺染色阳性细胞率达 (17.72±0.58)%,与HU100 μmol/L(15.72±0.27)%、NaB500 μmol/L(14.32±0.74)%比较差异有显著性(P<0.05);与亲本细胞比较Gγ-mRNA表达上调(2.04±0.13)倍,Aγ-mRNA表达上调(1.27±0.01)倍,差异有显著性(P<0.05).结论:低剂量HU与NaB联合用药能使K562细胞γ珠蛋白基因表达上调,并减轻细胞生长抑制,为临床联合用药提供实验依据.
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非缺失型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征复合β地中海贫血的研究进展
遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征（hereditary persis-tence of fetal hemoglobin，HPFH）是由于β珠蛋白基因簇中DNA序列的碱基替换或缺失导致出生后胎儿血红蛋白（fetal hemoglobin，HbF）持续增高的遗传性血红蛋白病［1］。 HPFH可分为缺失型HPFH和非缺失型HPFH（nd-HPFH）。 nd-HPFH是由于γ珠蛋白基因启动子区点突变或小片段缺失所致［2］。正常成人体内血红蛋白主要是HbA，HbF含量小于总血红蛋白的1％［3］。β地中海贫血（β地贫）是由于β珠蛋白基因缺陷或缺失使β珠蛋白肽链合成减少或缺如，导致血红蛋白组分改变的遗传性溶血性贫血，可分为轻型、中间型和重型，临床表现从几乎无症状到严重贫血［4－5］。 nd-HPFH复合β地贫的HbF明显升高，高水平HbF可通过平衡珠蛋白链合成而改善贫血症状［6］。广西、广东等南方地区是国内β地贫高发区，本文就nd-HPFH复合β地贫的基因突变类型和临床表现作一综述，为β地贫诊治提供理论依据。
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Aγ-225～-222缺失复合β地中海贫血的研究
目的:探讨A γ-225～-222缺失导致的非缺失型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征(nondeletional hereditary persistence of fetal hemoglobin,nd HPFH)复合β地中海贫血的基因突变和临床特征.方法:选择2013年6月至2014年7月在广西医科大学第一附属医院就诊的病例进行血常规检查;应用高效液相色谱法(HPLC)测定血红蛋白Hb F和Hb A2水平;应用DNA测序方法分析γ珠蛋白基因突变;应用反向斑点杂交(RDB)和gap-PCR方法检测地中海贫血基因突变;应用SPSS 16.0统计软件对数据进行统计分析.结果:在122例Hb F增高的病例中,检测出7例Aγ-225～222 AGCA缺失杂合子,其中3例复合Gγ-158 C→T突变杂合子,1例同时复合β地中海贫血28 A→G突变杂合子以及Gγ-158 C→T突变杂合子,1例复合β地中海贫血CD17 A →T突变杂合子.血常规检查显示7例Hb为96.7～142.3 g/L,MCV为54.61～77.65 fl,MCH为16.10～25.26 pg.Hb分析显示7例Hb F为4.0％～11.2％,其中复合Gγ-158 C→T突变杂合子HbF为4.0％～8.1％,复合β地中海贫血杂合子Hb F为8.1％～11.2％.5例Hb A2正常,2例复合β地中海贫血杂合子Hb A2增高(5.6％～6.4％).Aγ225～-222缺失复合β地中海贫血杂合子与β地中海贫血杂合子相比,Hb F、Hb水平明显升高(P＜0.05).结论:Aγ 225～222缺失可导致Hb F水平升高,其杂合子均无临床症状,Hb正常或降低,MCV、MCH降低.Aγ-225～-222缺失复合β地中海贫血杂合子的HbF、Hb水平明显高于β地中海贫血杂合子.
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MicroRNA-451和microRNA-503对羟基脲诱导的K562细胞γ珠蛋白基因表达的调控作用
目的:研究羟基脲对K562细胞γ珠蛋白基因表达的影响及其中可能涉及的microRNA(miR)调控作用,以探讨药物治疗β地中海贫血的新思路.方法:用不同浓度(0 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L)的羟基脲作用于K562细胞24 h、48 h、72 h、96h,采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测γ珠蛋白及相关miR基因相对表达水平.结果:K562细胞γ珠蛋白基因表达显著增高(P＜0.05),miR-451a和miR-503-3p基因表达明显升高(P＜0.01).结论:羟基脲能够诱导K562细胞γ珠蛋白基因高表达,其对γ珠蛋白基因的诱导作用可能通过促进miR-451a和miR-503-3p的表达来进行调控.
