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LRP16及与肿瘤的关系研究进展
人白血病相关蛋白16 (LRP16)属于macro domain家族.它在生物的发育过程和肿瘤的发生、发展中起着重要作用.在多种雌激素及雄激素依赖性肿瘤中高表达.LRP16是ERα的共激活因子,可以增强多种核受体家族成员的转录活性,包括AR、GR、ERβ、PPARα、PPARγ等.在NF-κB的激活中也起着重要作用.本文对LRP16及与肿瘤的相关性进行介绍.
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小鼠LRP16基因打靶载体的构建
目的:为利用基因敲除技术进行LRP16基因生理功能的研究,本研究构建了针对小鼠LRP16基因的打靶载体.方法:通过PCR方法筛选129品系小鼠基因组文库中LRP16克隆,在第5外显子内插入SA-RIES-β geo序列,构建插入失活型打靶载体. 结果:将包含第5至11外显子的LRP16基因组片段亚克隆到pBluescript SK Ⅱ+载体,SA-IRES-β geo序列正确插入第5外显子中. 结论:成功构建了第5外显子插入失活型LRP16基因打靶载体,为下一步筛选同源重组ES细胞奠定基础.
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抑制LRP16基因表达增加了肿瘤细胞辐射敏感性
目的:探索抑制LRP16基因表达对肿瘤细胞辐射治疗敏感性的影响.方法:采用逆转录病毒介导的小干扰RNA策略,建立了LRP16基因表达被稳定抑制的MCF-7及HeLa细胞系,采用电离辐射及紫外线(UV)分别照射LRP16基因被稳定抑制表达的MCF-7和HeLa细胞,于照射后不同的时间点进行Hoechst 33342染色以检测细胞凋亡率,并进行DNA片段化分析;胎盘蓝染色检测不同时间点的细胞死亡率.结果:照射后2～10 h之间,LRP16基因表达抑制组细胞的凋亡率明显高于对照组(P<0.05);照射后 10 h 胎盘蓝方法计数死活细胞,发现LRP16基因抑制组细胞的死亡率>40%,而对照组的死亡率在15%～20%之间;24 h 计数细胞死亡率发现LRP16基因抑制组细胞与对照组细胞差别不明显(P>0.05).结论:抑制LRP16基因在肿瘤细胞中的表达增加了瘤细胞的辐射治疗敏感性,其机制可能是通过抑制LRP16基因表达干预了辐射诱导DNA损伤反应的早期信号途径.
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小鼠LRP16基因同源重组ES细胞克隆的鉴定
目的:为深入研究LRP16基因的生理功能,本研究将小鼠LRP16基因特异打靶载体pB△16转染小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell),并筛选同源重组克隆.方法:通过电转染方法将LRP16插入失活型打靶载体导入ES细胞,经G418筛选,挑取抗性克隆,Southern blot方法鉴定同源重组ES细胞克隆.结果:打靶载体成功转染ES细胞,Southern blot筛选100个抗性克隆,结果显示有一个打靶序列同源重组型插入的ES细胞克隆.结论:筛选到同源重组型ES细胞,为下一步建立LRP16缺失型小鼠并为从整体水平研究LRP16基因的生理功能奠定基础.
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LRP16基因启动子的亚克隆及表达调控载体的构建
目的:为深入研究LRP16基因的表达调控机制,克隆及亚克隆了LRP16基因的启动子序列,构建LRP16基因启动子表达调控载体.方法:在NCBI的人类基因组数据库中截取并下载LRP16基因转录起始位点5′侧翼区约3kb的基因组序列设计PCR扩增引物,从健康外周血中扩增获得该片段,以此序列为基础进行亚克隆,分别获得6条5'端不等、3'端平齐的片段,后插入用于表达调控研究的pGL3-Basic载体.结果:获得了7条长度依次差别约为400bp的LRP16启动子克隆,分别构建了调控荧光素酶报告基因的真核表达载体.结论:上述载体的成功构建为信息资源与实验手段的有效结合克隆启动子序列提出了一种模式,并为LRP16表达克隆及启动子的活性分析奠定了基础.
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雌激素上调LRP16基因表达靶启动子区的研究
目的:鉴定雌激素上调LRP16基因表达关键的靶启动子区域并探讨其分子机制.方法:对LRP16基因5'-侧翼2.6kb中的-213bp至-24bp启动子区进行亚克隆,构建5个控制不同启动子长度的荧光素酶报告重组子PS7-11,以既往构建的pS5、pS6为对照,与雌激素受体α(ERα)真核表达载体共转染MCF-7和Hela细胞,加入雌二醇(17β-E2)刺激后通过Luciferase assay方法测定相对荧光素酶活性.结果:MCF-7和Hela两个细胞系各组相对荧光素酶活性值上升趋势相平行,-213 bp至-24 bp区域各启动子克隆均具有较高的转激活活性,特别是pS10,在MCF-7细胞中对报告基因的上调活性达427倍,远远高于PS5.结论:E2主要通过-213 bp至-24bp区域增强LRP16基因的转录,其中-213bp至-126bp(pS10)应为关键的启动子区.
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抑制LRP16基因的表达降低了MCF-7细胞对5-FU的杀伤敏感性
目的:探讨LRP16基因对MCF-7细胞增殖的影响及其潜在的临床意义.方法:既往用逆转录病毒介导RNA干扰的方法,已构建了能不同程度抑制MCF-7细胞LRP16基因表达的细胞系pL668(抑制率60%)、pL374(抑制率90%)及其阴性对照pGFPi细胞系.应用台盼蓝排斥实验法观察三种细胞增殖速率和用细胞周期S期特异性的化疗药物5-FU诱导pL374、pGFPi细胞的死亡情况.结果:pGFPi、pL668、pL374三种转染细胞的增殖能力依次降低(P<0.05).5-FU作用于细胞后,pGFPi从24h开始即有10%以上的细胞死亡,48h死亡率达20%,72h死亡率为75%,至96h基本全部死亡;而pL374在72h以后死亡率才明显上升,96h死亡率达30%.结论:抑制LRP16基因表达,可有效抑制MCF-7细胞的增殖,并降低了细胞对5-FU的杀伤敏感性.表明LRP16基因参与了MCF-7细胞周期转化的调节,可能作用于G1/S关卡点.提示该基因在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要的作用,可能是雌激素依赖性乳腺癌的一个良好治疗靶标.
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应用酵母双杂交方法筛选LRP16相互作用蛋白
目的:应用酵母双杂交技术筛选人乳腺癌细胞MCF-7中可与LRP16相互作用的蛋白.方法:将诱饵质粒pGBKT7-LRP16、MCF-7双链cDNA文库片段及线性化质粒pGADT7-Rec共转化AH109酵母菌,营养缺陷型培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)筛选阳性菌落.提取阳性克隆质粒进行PCR,将PCR产物测序,并将酵母质粒转化感受态大肠杆菌Top10获得与诱饵质粒有相互作用的单个文库质粒,测序后回复验证其在酵母中的相互作用.结果:获得8个与LRP16相互作用的候选蛋白,选取4个在酵母中进行回复验证,其中有3个可生长出阳性克隆.结论:应用酵母双杂交技术筛选出一族功能基本明确的可与LRP16相互作用的候选蛋白,为研究LRP16的病理生理功能和分子机制奠定了基础.
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雌激素上调LRP16基因表达的研究
目的:鉴定LRP16基因的表达调控途径并探讨其可能机制.方法:对LRP16基因进行启动子序列顺式作用元件和信息学角度的SAGE(serial analysis of gene expression)谱分析,提示雌激素对其可能具有转录调控作用.为证实这一作用,构建了LRP16基因启动子序列(2.6 kb)调控的荧光素酶报告子(pS0),并与雌激素受体α和β(ERα,ERβ)真核表达载体共转染COS-7和MCF-7细胞,加入雌二醇(β-E2)培养,luciferase assay方法测定相对荧光素酶活性.结果:报告子pS0与ERα真核表达载体共转染细胞的相对荧光素酶活性较非共转染组及pS0 /ERβ表达载体共转染组显著升高,并且在两种细胞中的升高幅度接近.结论:LRP16是受雌激素调控的一个新识别的靶基因,具体调控途径由雌激素变构激活的ERα直接介导,其临床意义有待进一步研究.
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LRP16反馈增强ERα介导转录激活活性的研究
目的:探讨LRP16对雌激素受体α(ERα)介导转录激活活性的反馈增强作用.方法:ERα模式启动子调控的荧光素酶报告子(3×ERE-Luc)或GC富含的ER反应性LRP16启动子S10(-101bp到-14 bp)调控的荧光素酶报告子(pGL-3-S10)与雌激素受体α(ERα)真核表达载体、LRP16真核表达载体(pcDNA3.1-16)共转染MCF-7细胞,测定3×ERE-Luc和pGL-3-S10的相对荧光素酶活性;3×ERE-Luc或pGL-3-S10与ERα真核表达载体、针对LRP16的小干扰RNA(LRP16-siRNA374、LRP16-siRNA668)或对照小干扰RNA(control-siRNA)共转染MCF-7细胞,测定3×ERE-Luc和pGL-3-S10的相对荧光素酶活性.结果:LRP16增强3×ERE-Luc和pGL-3-S10的相对荧光素活性,抑制LRP16表达显著削弱了3×ERE-Luc和pGL-3-S10的相对荧光素活性,并呈现剂量依赖性,该效应依赖于雌激素对ERα的激活.结论:ERα调控的靶基因LRP16反馈增强ERα介导的转录激活活性,是ERα的一个共激活因子.
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雌激素受体α与其靶基因LRP16相互作用的研究
目的:既往研究表明LRP16是雌激素受体α(ERα)诱导表达的一个靶基因,但可以反馈激活ERα介导的转录活性,本研究目的在于探讨该反馈效应的分子机制.方法:GST-pulldown与免疫共沉淀(CoIP)方法检测LRP16与ERα体内外的相互作用.结果:GST-pulldown与CoIP实验结果均表明LRP16与ERα可以直接结合,并且表明该相互作用不依赖于雌激素的存在,但雌激素可以增强二者的结合.结论:LRP16不仅是ERα的一个下游靶基因,而且是ERα的一个共激活因子.
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LRP16基因通过上调GLUT-2促进MIN6细胞胰岛素分泌
目的:探讨LRP16基因对MIN6细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响及其可能机制.方法:用SuperFect脂质体转染法建立稳定过表达LRP16基因的MIN6细胞株,以转染空质粒的MIN6细胞株作为对照.检测两组细胞的增殖、胰岛素分泌及GLUT-2蛋白的表达情况.结果:过表达组的增殖与对照组相比无显著差别(P>0.05);在0mmol/L、 3mmol/L、 30mmol/L葡萄糖刺激下,过表达组的胰岛素分泌量分别为对照组的2.26倍、 2.19倍和2.16倍(P<0.05);western blot显示过表达组GLUT-2蛋白量比对照组显著上调(P<0.05).结论:过表达LRP16基因不能促进MIN6细胞增殖,但可以通过上调GLUT-2促进胰岛素分泌.表明LRP16基因促进胰岛素分泌的作用不依赖细胞增殖,而依赖细胞对葡萄糖摄取的增加.
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应用基因芯片技术研究LRP16基因对成熟脂肪细胞功能的影响
目的:探讨LRP16基因对成熟脂肪细胞功能影响及其潜在的临床意义.方法:应用高通量基因芯片分析技术,比较高表达LRP16的成熟脂肪细胞与正常表达组的差异.结果:实验组与对照组间差异表达基因共有1 222个,其中653个上调, 569个下调.结论:对脂肪细胞LRP16的总体功能是促进(微)炎症状态,对脂肪分化、胰岛素抵抗以及糖脂代谢都有影响.
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Gateway技术构建转基因重组质粒pRP.EX3d-EF1A-LRP16-His-IRES-eGFP
目的：构建转基因重组质粒pRP.EX3d-EF1A-LRP16-His-IRES-eGFP，为转基因鼠的建立奠定基础。方法利用重叠PCR技术扩增attB1-LRP16-His-attB2，经BP反应，将LRP16基因插入到载体pDown上，pUp-EF1A、pDown-LRP16-His、pTail-IRES-eGFP和PRP.Des3d经LR反应，将LRP16转移到pRP.EX3d上，转化Stbl3细胞，用氨苄西林进行抗性筛选，经PCR鉴定后将阳性克隆送测序。结果测序及酶切结果验证获得正确的pRP.EX3d-EF1A-LRP16-His-IRES-eGFP重组质粒。结论成功构建pRP.EX3d-EF1A-LRP16-His-IRES-eGFP重组质粒，可用于下一步LRP16转基因小鼠的构建。
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LRP16基因在乳腺癌中的表达及临床意义
目的:检测LRP16基因在乳腺癌中的表达及与乳腺癌预后的相关性.方法:用免疫组化方法检测62例临床乳腺癌标本中LRP16、ER、PR和E-cadherin的表达.结果:LRP16、ER、PR和E-cadherin在临床乳腺癌标本中表达的阳性率分别为56.5%、56.5%、48.4%、40.3%.LRP16在临床乳腺癌中的表达与肿瘤大小、腋窝淋巴结转移、临床分期、ER表达呈正相关,与E-cadherin表达呈负相关(P＜0.05).E-cadherin在临床乳腺癌标本中的表达与腋窝淋巴结转移、临床分期呈明显负相关(P＜0.05).结论:LRP16与乳腺癌生物学行为密切相关,可以作为乳腺恶性程度评判的新指标.
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LRP16在胰岛素瘤中的表达及临床意义
目的 检测LRP16在胰岛素瘤中的表达及与临床病理特征的相关性.方法 应用免疫组化的方法检测34例临床胰岛索瘤标本中LRP16、ERα、ERβ的表达情况.结果 LRP16、ERα、ERβ在胰岛素瘤中表达的阳性率分别为79.4％、76.4％、47.1％.LRP16与ERα的表达呈正相关性,但与患者年龄、性别、肿瘤大小、血糖水平、血浆胰岛素水平等临床特征未发现明显相关性.结论 LRP16、ERα在胰岛索瘤中均有较高表达,LRP16与ERα表达呈正相关性,提示这些蛋白参与了胰岛素瘤的发病机制.
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小鼠LRP16基因打靶载体的构建和同源重组型胚胎干细胞筛选
背景:LRP16基因是一个雌激素反应基因,其表达水平与乳腺癌细胞增殖及侵袭密切相关.目的:构建针对小鼠LRP16基因的打靶载体,转染胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell)并筛选同源重组克隆.设计:通过SA-PIES-βgeo插入小鼠LRP16基因组DNA构建插入失活型打靶载体.单位:日本九州大学第三内科生物调控研究室与解放军总医院分子生物室.材料:本实验所用主要材料由日本九州大学生物调控研究室提供.实验所用鼠基因组文库(mouse genomic library in pBeloBAC11 Vector)购自invitrogen公司,TopF10感化态细菌购自北京天为时代公司,pCDNA3.1(+)由本室保存.鼠胚胎干细胞株由日本九州大学提供.方法:实验主要工作于2004-11/2005-05在日本九州大学生物调控研究室与解放军总医院分子生物室完成.PCR方法筛选129品系小鼠基因组文库中LRP16克隆,在第5外显子内插入SA-RIES-βgeo序列,构建捅入失活型打靶载体并转染胚胎干细胞,经G418筛选,挑取抗性克隆,Southern blot方法鉴定同源重组胚胎干细胞克隆.主要观察指标:具有同源重组的胚胎干细胞克隆.结果:将包含第5至11外显子的LRP16基因组片段亚克隆到pBluescript SKⅡ+载体.SA.IRES-βgeo序列的正确插入第五外显子中,打靶载体成功转染胚胎干细胞,Southern blot结果显示具有一个打靶序列同源重组型插入的胚胎干细胞克隆.结论:成功构建了第五外显子插入失活型LRP16基因打靶载体并筛选到同源重组犁胚胎干细胞.
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LRP16在子宫内膜样腺癌中的表达分析
目的:探讨正常子宫内膜和子宫内膜样腺癌组织中LRP16的表达及其与人子宫内膜腺癌的相关性.方法:应用RT-PCR技术研究10例正常子宫内膜组织及26例不同分化程度的子宫内膜样腺癌组织中LRP16 mRNA的表达；采用免疫组织化学方法检测上述子宫内膜癌组织中LRP16蛋白产物表达部位及表达水平.结果:子宫内膜样腺癌组织中LRP16mRNA的阳性表达率及表达水平(分别为83.33％、0.82±0.21)明显高于正常子宫内膜组织(分别为30％、0.47±0.18),P＜0.05.LRP16在26例子宫内膜癌组织细胞核或胞浆中呈阳性表达,核阳性表达率为73.08％,浆阳性表达率96.15％.在不同分化程度的子宫内膜癌组织中:LRP16核表达与癌细胞的分化程度呈负相关(P＜0.05),而LRP16浆表达与癌细胞的分化程度无相关性(P＞0.05).结论:子宫内膜癌组织中LRP16 mRNA的表达明显高于正常子宫内膜组织；且LRP16蛋白产物核表达水平与癌细胞的分化程度呈负相关；过高表达的LRP16与子宫内膜癌的发生和发展可能存在重要联系.
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LRP16影响宫颈癌Siha细胞对化疗药物的敏感性
目的:探讨抑制LRP16的表达对宫颈癌Siha细胞的化疗药物敏感性的影响.方法:将抑制LRP16表达的小干扰RNA:negativecontrol-siRNA(NC)、siRNA-374(si374)转染入Siha宫颈鳞癌细胞系中,通过顺铂(DDP)和紫杉醇(TAX)的处理后,采用CCK-8检测不同浓度紫杉醇、顺铂作用宫颈癌细胞系Siha48h后,计算出细胞被抑制一半时顺铂、紫杉醇的药物浓度(IC50);使用Hoechst33342染色观察细胞凋亡,采用流式细胞仪检测顺铂IC50作用Siha细胞48小时后的细胞凋亡情况,紫杉醇IC50作用Siha细胞之后的细胞周期分布情况.结果:CCK-8检测转染的Siha细胞增殖活性受到抑制,Hoechst33342染色观察转染的Siha 细胞凋亡明显增加,流式细胞仪检测凋亡显示,si374+顺铂的早期凋亡率22.15±2.24,NC+顺铂12.45±2.72,流式细胞仪检测周期显示G2/M(％),si374+紫杉醇29.94±1.87,NC+紫杉醇17.66± 2.32.结论:LRP16基因表达下调之后,抑制Siha细胞的增殖、促进其凋亡,使细胞周期滞留于G2/M期,从而提高Siha细胞的化疗敏感性.
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shRNA慢病毒载体稳定抑制LRP16表达的HepG2细胞的构建及鉴定
目的:构建LRP16基因抑制表达的HepG2稳定细胞系,鉴定其LRP16基因抑制表达的效果.方法:构建LPP-HSH008357-LVRH1GP-200短发卡RNA (shRNA)慢病毒表达载体,用该抑制表达慢病毒感染HepG2细胞系,通过荧光筛选及药筛,获得LRP16基因稳定抑制表达细胞系;终运用Q-PCR和Western blot鉴定该稳定细胞系中LRP16的表达.结果:构建了LRP16基因抑制表达及抑制表达对照的HepG2稳定细胞系,并通过Q-PCR和Western blot进行了鉴定.Q-PCR结果显示相对于对照稳转株(LPP-CSHCTR001-LVRH1GP-100),抑制表达稳转株(LPP-HSH008357-7-LVRH 1GP-200)LRP 16基因的抑制效率是4组抑制表达细胞中效果理想的一组,其抑制效率高达98％;Western blot结果也显示该抑制表达稳转株(LPP-HSH008357-7-LVRH 1GP-200)的LRP16蛋白表达量明显低于野生型HepG2细胞及对照稳转株(LPP-CSHCTR001-LVRH 1GP-100),其结果与Q-PCR一致.结论:构建并鉴定了人LRP16基因抑制表达HepG2稳定细胞系及其相应的对照稳转株.
