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传代培养对基于肽质量指纹谱的细菌识别稳定性的影响分析
目的 应用肽质量指纹谱技术对多次传代细菌进行识别,分析细菌传代对细菌识别能力的影响.方法 将幽门螺杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌分别连续传57、50、100代,金黄色葡萄球菌留取抗原.每一代新鲜培养菌和冻存抗原通过乙醇/甲酸法提取蛋白,采用肽质量指纹谱技术进行谱图采集和菌株鉴定.进一步采用NanoLC-MS/MS对幽门螺杆菌基于肽质量指纹谱识别的蛋白进行批量鉴定.结果 幽门螺杆菌、大肠埃希菌分别连续传57代和50代,采用肽质量指纹谱每代均能正确识别到种水平;金黄色葡萄球菌连续传100代,采用肽质量指纹谱每代新鲜菌株及冻存抗原均能正确识别到种水平,各代冻存抗原和新鲜菌株的肽质量指纹谱具有很好的一致性.幽门螺杆菌蛋白扫描分析,鉴定出206个蛋白,包括各种酶类(29.6％)、核糖体蛋白(15.5％)、外膜蛋白(10.7％)、假想蛋白(19.0％)、转运相关蛋白(2.0％)、其他蛋白(22.0％).结论 细菌连续传代和抗原冻存不影响肽质量指纹谱对菌株的正确识别,细菌的肽质量指纹谱具有传代稳定性.
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实验性精索静脉曲张大鼠附睾分泌蛋白的鉴定研究
目的研究精索静脉曲张对附睾合成与分泌蛋白的影响,鉴定病理状况下附睾特异改变的蛋白成分. 方法部分结扎左肾静脉建立实验性左侧精索静脉曲张大鼠动物模型.用SDS-PAGE和双向电泳分离左附睾尾匀浆上清中的蛋白质组分,切下稳定出现改变的蛋白质所在的条带或斑点,进行胶内胰蛋白酶消化,酶解得到的终肽混合物进行肽质量指纹谱测定.通过检索互联网上的蛋白质数据库确定该蛋白的可能成分. 结果与对照动物相比,实验性左侧精索静脉曲张大鼠左附睾尾匀浆上清中一分子量约20×103、等电点约5.5的蛋白成分明显增加.经质谱分析结合网上数据库检索表明,该蛋白是附睾视黄酸结合蛋白. 结论实验性左侧精索静脉曲张导致大鼠附睾中视黄酸结合蛋白含量升高,这一改变对精子在附睾中成熟及精子功能的影响有待进一步研究.
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腋淋巴结阳性乳腺浸润性导管癌差异蛋白的质谱分析
目的 筛选可能用于判断乳腺浸润性导管癌发生腋淋巴结转移的血清蛋白标志物.方法 收集2015年3月—2016年5月天津市宝坻区人民医院收治的乳腺浸润性导管癌患者血清样本24份,按照是否发生腋淋巴结转移分为两组,每组各12份.将每组的12份血清等量混合,利用双向凝胶电泳(2D-PAGE)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术鉴定差异蛋白质,对2D-PAGE图谱与MALDI-TOF-MS质谱进行分析.结果 2D-PAGE图谱分析筛选出差异蛋白点11个;经MALDI-TOF-MS质谱分析鉴定出高可信度的蛋白5种,表达上调的为T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)、组织蛋白酶K(CatK)、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、肌动蛋白相关蛋白复合物3(ARPC3),表达下调的为抑癌蛋白Necdin(覆盖率分别为Tiam1蛋白29％,CatK蛋白12％,VEGF-B蛋白34％,ARPC3蛋白26％,Necdin蛋白18％).结论 乳腺浸润性导管癌发生腋淋巴结转移后其蛋白质表达谱也发生了变化,所鉴定出的差异蛋白有可能成为判断其是否发生腋淋巴结转移的血清蛋白标志物.
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小鼠小肠上皮细胞经γ射线照射后蛋白质组差异分析
目的分析γ射线照射后,在辐射损伤期和修复期小鼠肠上皮细胞蛋白质组的改变,以探讨肠上皮细胞损伤与修复的分子机理.方法采用9 Gy全身照射BALB/c小鼠,分别于照射后3 h和72 h取小肠制备卷肠切片,染色并观察小肠形态.分离未照射小鼠及照射后3 h和72 h小鼠的肠上皮细胞,制备蛋白样品,采用双向电泳技术分离样品,PDQuest软件处理双向电泳图谱;并对差异的蛋白质点进行肽质量指纹分析.结果小鼠肠上皮在照射后3 h以损伤性改变为主,72 h后出现明显再生修复.采用双向电泳技术在正常对照组、照射后3 h组以及照射后72 h组分别检测到(638±39)、(566±32)和(591±29)个蛋白质点.对其中28个差异蛋白质点进行了肽质量指纹分析,经数据库检索,初步鉴定为一些与代谢、过氧化应急、信号转导相关的蛋白质.结论电离辐射能诱导小鼠肠上皮细胞蛋白表达的改变,双向电泳技术对从整体方面揭示辐射损伤的分子机理有重要价值.
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应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱源后衰变技术鉴定蛋白质
目的应用源后衰变(PSD)技术结合数据库检索鉴定二维蛋白质电泳(2DE)胶上的蛋白质斑点.方法用已知多肽(ACTH)18～39肽段和TPA被胰酶降解后的1个肽段建立了PSD-MALDI-TOF-MS方法.结果应用已建立的PSD-MALDI-TOF-MS法分别将2DE分离后胶上的2个未知蛋白质斑点鉴定为40S核糖体蛋白S12和dnaK抑制蛋白.结论PSD技术在蛋白质组学研究中有较大的应用前景.
关键词： 蛋白质组学 源后衰变 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 肽质量指纹谱 多肽测序 -
乙酰唑胺对大鼠肾脏近曲小管上皮细胞作用的差异蛋白分析及其与AQP1抑制的关系
目的研究乙酰唑胺抑制大鼠肾脏近曲小管上皮细胞水孔蛋白1(aquaporin-1,AQP1)表达的内源性机制.方法将原代培养的大鼠肾脏近曲小管上皮细胞分为两组,一组给予1×10-5 mol*L-1乙酰唑胺,另一组为阴性对照.待细胞长至亚融合状态时裂解细胞,用等电聚焦电泳对裂解物进行差异蛋白筛选,并对差异蛋白作肽质量指纹谱鉴定.结果给乙酰唑胺后细胞中出现两个差异蛋白,其中等电点(pI)为3.8的蛋白给药后的表达减少,数据库检索发现其氨基酸序列与来源于大鼠肝脏和睾丸的刷状缘肌球蛋白有21.4%的相似性;而与来源于大鼠脑的糖原磷酸化酶有27%相似性.另外一条pI为5.5的蛋白被诱导增多,它与来源于大鼠肺脏的α亚型磷脂酰肌醇转移蛋白的相似性为20%.结论乙酰唑胺可能通过影响pI 3.8蛋白或pI 5.5蛋白的表达来抑制AQP1的基因表达.
关键词： 乙酰唑胺 水孔蛋白 肾脏近曲小管上皮细胞 肽质量指纹谱 -
小鼠肝脏部分耐热蛋白的初步研究
目的:研究小鼠肝脏中具有耐热特性的蛋白质,尤其是与肝功能、肝脏再生有密切关系的耐热蛋白.方法:将小鼠肝脏蛋白在65℃处理30 min,去除热变性蛋白,剩余耐热蛋白进行二维电泳,经过考马斯亮蓝染色,得到小鼠肝脏耐热蛋白二维电泳图谱,共约50个蛋白斑点.其中选取5个相对分子质量在10 000～50 000、分离效果较好的斑点进行MALDI-TOF-MS肽质量指纹谱分析及生物信息学处理.结果:这5个蛋白分别为:谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase)、蛋白酶体亚单位(AF060087)、尼克酰胺乙酰乙酸水解酶(nicotinate-nucleotide pyrophosphorylase)、延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumary-lacetoacetate hydrolase)和regucalcin.结论:初步证明肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶、尼克酰胺乙酰乙酸水解酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶和regucalcin具有较强的耐热特性.
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异烟肼耐药和敏感结核分枝杆菌的比较蛋白质组织学研究(摘要)
目的研究结核分枝杆菌异烟肼耐药菌株与敏感菌株的蛋白质表达差异,鉴定结核分枝杆菌中与异烟肼耐药相关的菌体蛋白.方法应用双向电泳技术比较2株异烟肼耐药菌株与2株敏感菌株的全菌蛋白表达图谱差异,发现异烟肼耐药结核分枝杆菌表达量显著增加26个蛋白质斑点,通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪进行质谱分析,获得6个明确的肽质量指纹谱,通过蛋白质数据库进行检索分析.结果6个蛋白分别为海藻糖磷酸酶、铁钼蛋白A、莽草酸5脱氢酶、葡萄糖胺果糖6磷酸氨基转移酶、吲哚3甘油磷酸合成酶、TetR家族转录词控因子.结论上述蛋白的鉴定将对发现新型抗结核药物靶位和异烟肼耐药结核病诊断的分子标志物可能有所裨益.
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结膜松弛症泪液蛋白质肽质量指纹谱分析
目的 分析结膜松弛症泪液蛋白表达谱的变化.方法 收集22例结膜松弛症患者和13例正常对照组的泪液样本,毛细管从每眼收集15μL泪液,采用Zip Tip C18柱浓缩和纯化泪液样本,利用基质辅助的激光解吸质谱进行线性模式和肽质量指纹谱(PMF)检测,并对PMF图谱数据进行多变量数据统计分析,比较结膜松弛症组和正常对照组的泪液PMF的差异.结果 2组泪液的质谱检测峰在数量上差异无统计学意义(P>0.05),主成分分析结合偏小二乘法分析显示结膜松弛症组泪液蛋白质表达与正常对照组比较有差异,结膜松弛症组泪液蛋白质表现为"离群"样本,且离群分散度较大的样本为结膜松弛症Ⅳ级的患者.结论 应用Zip Tip C18柱分离联合基质辅助的激光解吸质谱技术可有效筛查泪液蛋白质.对PMF图谱进行多变量数据统计分析,可以观察到结膜松弛症组与正常对照组泪液蛋白质存在差异,并可为结膜松弛症,临床诊断、疾病发生发展的机理及治疗提供参考.
关键词： 泪液蛋白质 结膜松弛症 基质辅助的激光解吸质谱 肽质量指纹谱 主成分分析 -
中药治疗激素性骨坏死的蛋白质组学分析
目的:用蛋白质组学的研究方法进行激素性骨坏死的病理和中药作用机理的研究,有利于临床治激素性骨坏死.方法:按照常用激素性骨坏死的造模方法,建立大鼠坏死模型,并设立中药治疗组及空白对照组,经过6周处理后经骨形态学检查,确定骨坏死造模成功,处死动物取股骨和肱骨,提取骨组织蛋白质样品,双向电泳分离,得到各组骨组织总蛋白质分子解剖图谱,用图像分析软件,找到各组间差异蛋白质点,进一步行胶内酶切,MADITOF/MS质谱分析,得到各差异点的蛋白质肽指纹图谱,结合蛋白质生物信息库(Matrix science Ltd database),对各蛋白质进行初步鉴定.结论:初步鉴定了3个差异蛋白,分别为阻凝蛋白重链ⅡB、磷脂谷胱甘肽过氧分酶及泛素化酶E2(MW:17 kd),初步认为这三种蛋白质在激素性骨坏死的发病及中药治疗过程中发挥着重要调控作用.
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二磷酸果糖对低温保存兔心肌组织蛋白质的影响
目的研究二磷酸果糖(FDP)对低温保存兔心肌组织蛋白质的影响.方法兔心肌组织分别在4 ℃保存于含5 mmol·L-1FDP或无FDP的St Thomas液中,提取心肌组织蛋白质经SDS凝胶电泳比较,肽质量指纹谱质谱分析和Western blot鉴定蛋白质分子.结果肽质量指纹谱分析鉴定到β-肌球蛋白重链、莱恩素受体(ryanodine receptor)、α肌动蛋白、电压依赖的阴离子通道蛋白1(VDAC1)和腺苷酸激酶3等5种蛋白质差异,Western blot鉴定到β-肌球蛋白重链、蛋白激酶Cε(PKCε)和IgG重链3种蛋白质差异.加入FDP后心肌组织中β-肌球蛋白重链、α肌动蛋白和PKCε得到更好保存.结论 FDP可以增加低温保存的兔心肌组织中一些与心功能相关的重要的蛋白质的保存量,以上所述的存在差异的蛋白质,在心脏低温保存条件研究中,具有作为生物标记分子的潜在应用价值.
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人大肠癌不同转移潜能细胞株SW620及SW480的差异蛋白质组分析
目的分析比较人大肠癌不同转移潜能细胞株的差异表达蛋白质图谱,筛选并探讨肿瘤转移相关蛋白与大肠癌发生发展转移的关系.方法利用双向凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解析离子化-飞行时间-质谱技术,分析高低转移性细胞株SW620和SW480蛋白质图谱的差异表达,查询数据库筛选大肠癌转移相关蛋白质.结果MalenieⅢ软件分析3次相同条件下的2-DE图谱,结果显示重复性、匹配性较好.SW620检测到(1316±62)个蛋白点,平均匹配率82%;SW480检测到(1332±74)个蛋白点,平均匹配率80%;蛋白点分布以PI 4～7、相对分子质量20 000～70 000范围内多.两种细胞株25个差异蛋白点(SW620 14个、SW480 11个)胰酶胶内酶解、质谱分析获得23张肽质量指纹谱;数据库查询结果高度匹配已知蛋白质3个,初步匹配已知蛋白质或片段14个.在这些差异表达的蛋白质中,部分与基因转录、细胞周期、信号转导、细胞凋亡有关,可能参与大肠癌的分化、增殖、侵袭、黏附和转移等多种生物学行为.结论人大肠癌不同转移潜能细胞株SW620和SW480的2-DE蛋白质图谱具有明显的差异表达,提示大肠癌转移过程的发生是多种蛋白质功能共同作用的结果.
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小鼠肝癌细胞H22源exosomes的制备及其免疫相关蛋白的初步研究
目的 分离提取和电镜观察小鼠肝癌细胞H22分泌的exosomes,并检测其含有的蛋白成分,为exosomes作为肿瘤疫苗提供理论依据.方法 超速分级离心和蔗糖密度梯度离心纯化得到exosomes,并经透射电镜观察鉴定,运用肽质量指纹谱质谱分析和Western blot检测exosomes 含有的蛋白成分.结果 从小鼠肝癌细胞H22中提取出exosomes,直径约为20～90 nm的膜性囊泡,呈圆形或椭圆形.该exosomes含有热休克蛋白(HSP)70、ICAM-1、延伸因子G2、动力蛋白轻链A、C-myc和Vav-2蛋白.结论 超速分级离心和蔗糖密度梯度离心提取纯化exosomes的方法具有可行性,小鼠肝癌细胞H22源exosomes表达有与抗原呈递相关蛋白(HSP70、ICAM-1),迁移相关蛋白(动力蛋白轻链A),粘附相关蛋白(ICAM-1),细胞骨架相关蛋白(延伸因子G2),肿瘤相关蛋白(C-myc蛋白、Vav-2蛋白),具有免疫原性.
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大鼠肝叶切除后肝细胞再生相关蛋白的蛋白质组学分析
目的 通过对肝叶切除后6、24 h的肝细胞与正常肝细胞的蛋白质组分析,筛选出与肝细胞再生相关的蛋白质.方法 选择雄性SD大鼠9只(体质量200 g),分3组,6 h组、24 h组和对照组,每组3只,建立大鼠70%肝叶切除模型.6 h组在肝叶切除后6 h分离肝细胞,24 h组在肝叶切除后24 h分离肝细胞,对照组为正常肝细胞.裂解液裂解细胞提取总蛋白,运用蛋白组学相关技术分析3组细胞的蛋白组学差异.结果 总共得到47个差异蛋白质点,鉴定出42个.结论 我们的数据显示:24 h组与对照组和6 h组都有重叠,而6 h组和对照组重叠部分较少,推测其可能的原因为6 h组肝细胞处于肝再生的启动阶段,与对照组差异较大,而24 h组,肝再生已启动,各种维持肝细胞正常功能的蛋白质也开始表达.
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应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱和N端测序鉴定重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的结构
目的:应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和N端测序方法鉴定重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的结构.方法:1.用Edman降解法进行N端测序.2.应用MALDI-TOF-MS测定分子量并鉴定纯度.3.通过还原、烷基化确定rhGM-CSF分子中二硫键数目.4.通过蛋白内切酶Glu-C酶切的肽质量指纹谱确证氨基酸序列并确证其中两对二硫键的配对.结果:1.测定的rhGM CSF N端15个氨基酸序列与从cDNA推导的序列一致.2.测定的rhGM-CSF分子量与理论计算值一致.3.证明rhGM-CSF没有自由巯基,含有两对二硫键,与理论值一致.4.证明rhGM-CSF的氨基酸序列是正确的,并确证其中的两对二硫键配对正确.结论:确证重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的结构是正确的,没有修饰、变异和氨基酸的丢失.应用的方法灵敏、准确、可靠.
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小鼠胚泡黏附时子宫内膜Galectin-1的变化
目的:探讨小鼠胚胎黏附时子宫内膜Galectin-1的变化.方法:双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)分析妊娠d 5小鼠胚泡黏附时着床点、着床旁子宫内膜总蛋白,以同龄未交配鼠子宫内膜为对照,差异蛋白质组学显示pI约5.1、分子量约15ku的蛋白点在着床点、着床旁子宫内膜表达上调,且在着床点更明显.对此蛋白点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其胶内酶解后的肽质量指纹谱(peptide mass fingerprint,PMF).结果:Mascot:PMF在SWISS-PROT数据库查询为鼠源性Galectin-1.RT-PCR结果显示d 5孕小鼠子宫内膜Galectin-1 mRNA水平也明显增加.结论:Galectin-1可能参与胚泡着床这一重要生命活动过程.
关键词： Galectin-1 着床 蛋白质组 肽质量指纹谱
