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光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌环境分离株的氟康唑敏感性与多位点序列分型分析
目的 分析分离自树叶、树皮和腐殖质的光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌,对其进行耐药性分析和分子流行病学分型,比较环境分离株与临床分离株的进化关系,为流行病学调查及有效控制侵袭性假丝酵母菌感染提供理论支持.方法 2017年9月采集云南省境内环境标本,分离培养提取菌株DNA进行转录间隔区测序鉴定;使用微量肉汤稀释法进行氟康唑药敏实验;采用多位点序列分型进行分子流行病学分型;利用eBURST分析菌株亲缘性.结果 采集环境标本200份,分离光滑假丝酵母菌3株和热带假丝酵母菌10株.13株环境分离株均对氟康唑敏感.3株光滑假丝酵母菌的序列型均为ST3,10株热带假丝酵母菌被分为7个二倍体序列(DST),包括4个新DST型(DST813～DST816).eBURST分析显示,光滑假丝酵母菌均为CC3型,CC730是热带假丝酵母菌环境株的主要型别.结论 环境分离株与临床分离株存在相同的起源株.树叶、树皮或腐殖质中的光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌可能对人类健康造成危害,是人类假丝酵母菌感染的潜在来源.
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体内外光滑假丝酵母菌氟康唑耐药机制的比较研究
目的 研究比较临床分离和体外诱导的耐氟康唑光滑假丝酵母菌的耐药机制.方法 选取临床分离的4对氟康唑敏感-耐药配对的光滑假丝酵母菌,其中4株敏感株在体外氟康唑的作用下均被诱导为耐药株.利用罗丹明6G试验比较敏感株与两种耐药株的外排泵作用,实时荧光定量RT-PCR检测外排相关基因CDR1、CDR2、SNQ2和ERG11的表达.同时,对PDR1基因进行PCR扩增和测序,对比分析临床耐药株和体外诱导耐药株的突变位点.结果 临床耐药株和体外诱导耐药株外排泵的功能均明显强于敏感株；两者CDR1表达均显著升高,而CDR2和SNQ2则无明显变化；ERG11在敏感与耐药菌株之间的表达水平也无显著差别；两种耐药株的PDR1均发现错义突变位点,其中P927S、L543P及S947L突变尚未被报道过.结论 光滑假丝酵母菌在体内外氟康唑作用下PDR1均产生突变,引起外排相关基因,尤其是CDR1的表达增加从而增强了外排泵的作用导致耐药.
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光滑假丝酵母菌感染实时荧光定量PCR检测方法的建立
目的:建立、优化快速检测临床标本中光滑假丝酵母菌的实时荧光定量PCR方法,并评价其临床应用价值.方法:以光滑假丝酵母菌ITSⅡ基因的一段高度保守序列为扩增靶序列,合成引物和探针,并与pMD19-T构建重组质粒作为标准品,建立检测光滑假丝酵母菌的实时定量荧光PCR方法.从线性范围、重复性、敏感性、特异性等4个方面对反应体系进行方法学评价.用建立的实时荧光定量PCR方法对1 042例临床标本(包括血液、尿液、痰液、胸水、支气管肺泡灌洗液)进行检测,并与真菌培养法进行比较.结果:建立的光滑假丝酵母菌实时荧光定量PCR方法的灵敏度可达10 CFU/ml；与人类基因组、细菌及其他真菌无交叉阳性反应.重复检测样本,其循环阈值的试验内及试验间变异系数均小于10％.用于临床标本检测时共检出96份阳性标本,与真菌培养法(检出93份阳性标本)的一致性好(Kappa值为0.925).结论:实时荧光定量PCR方法检测光滑假丝酵母菌灵敏度高、特异性及重复性好；可直接用于各种临床标本中光滑假丝酵母菌的检测,能大大缩短报告时间,为临床诊断提供可靠依据.
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伏立康唑治疗肺部光滑假丝酵母菌感染临床观察
目的 总结伏立康唑治疗光滑假丝酵母菌肺部感染老年患者的临床疗效.方法 收集2008年9月—2011年4月使用伏立康唑治疗光滑假丝酵母菌肺部感染患者临床资料,对其临床疗效和预后进行回顾性总结分析.结果 伏立康唑治疗光滑假丝酵母菌肺部感染患者临床总有效率75.9％,真菌清除率65.5％,死亡7例；预后分析显示APACHEⅡ是影响预后的独立危险因素(P=0.013).结论 伏立康唑治疗老年患者光滑假丝酵母菌肺部感染临床疗效安全有效.
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新生儿感染光滑假丝酵母菌随机扩增DNA多态性分析
目的：探讨采用随机扩增DNA多态性（RAPD）技术对临床新生儿血培养标本中分离的光滑假丝酵母菌进行基因分型；分析新生儿感染菌株的同源性，追踪其感染源与传播途径，从而为新生儿假丝酵母菌感染防治提供依据。方法15例新生儿血培养标本中分离的菌株均经过法国科马嘉假丝酵母菌显色鉴定培养基和法国生物梅里埃API20 CAUX酵母菌鉴定试剂盒进行鉴定、纯化，其后采用RAPD多态性分析，获得菌株的RAPD指纹图，应用NTSYS软件计算出相似系（SAB），并进行聚类分析，比较菌株间的同源性。结果15株菌株中14株被鉴定为光滑假丝酵母菌，1株为白色假丝酵母菌，且鉴定分离的2～14号的光滑假丝酵母菌相似系数均≥0．8，表明菌株之间基因型相似度较高，具有基因同源性，而第一株菌株与其他13株之间的相似系数均＜0．6，不具有基因同源性。结论本研究发现新生儿感染的13株光滑假丝酵母菌具有基因同源性，初步证实了试验分离的光滑假丝酵母菌在住院患儿间进行水平传播，提示了光滑假丝酵母菌易引起新生儿院内交叉感染，预防宜采取综合措施，切断传播途径。
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光滑假丝酵母菌耐药基因CDR1、CDR2、SNQ2表达的研究
目的:探讨光滑假丝酵母菌耐三唑类抗真菌药物临床株耐药基因表达情况.方法:34株复发性外阴阴道假丝酵母菌病的临床分离株,通过265 rDNA D1/D2区分子鉴定为光滑假丝酵母菌,应用法国生物梅里埃酵母菌药敏试剂盒ATBTM FUNGUS3,进行体外药物敏感性试验.实时荧光定量PCR方法检测34株菌株耐药基因CDR1、CDR2、SNQ2表达量.结果:34株光滑假丝酵母菌中,有2株为敏感株,2株对ITR剂量依赖敏感,30株为耐药株,且呈现交叉耐药现象.对氟康唑(FCA)、伊曲康唑(ITR)、伏立康唑(VRC)抗真菌药物的耐药率分别为26.32％、86.84％、34.21％.耐药株CDR1、SNQ2基因表达明显高于敏感株(P＜0.0005),CDR2表达量无差别(P＞0.05).结论:光滑假丝酵母菌对三唑类药物MIC值高,其药物敏感性低与耐药基因CDR1、SNQ2的过度表达有关.
关键词： 光滑假丝酵母菌 耐药性 基因表达 CDR1 CDR2 SNQ2 -
复发性外阴阴道假丝酵母菌病真菌培养及药敏情况分析
目的 探讨复发性外阴阴道假丝酵母茵病(recurrent vulvovaginal candidiasis,RVVC)中,白假丝酵母菌与光滑假丝酵母茵在体外对克霉唑、氟康唑、咪康唑、伊曲康唑和制霉菌素五种抗真菌药物敏感情况.方法 应用纸片扩散法,对2006 - 2012年1458例RVVC的假丝酵母菌进行体外药物敏感试验,比较白假丝酵母茵与光滑假丝酵母茵药物敏感情况.结果 RVVC患者中,白假丝酵母菌占82.1％,光滑假丝酵母菌占16.3％,白假丝酵母菌(99.1％)和光滑假丝酵母菌(99.6％)对制霉菌素的敏感率均很高；光滑假丝酵母茵对克霉唑(50.2％)和氟康唑(74.3％)的耐药率均高于白假丝酵母菌对克霉唑(2.4％)和氟康唑(13.2％)的耐药率；白假丝酵母茵对咪康唑和伊曲康唑的耐药性和敏感性差异无统计学意义(P＞0.05),但光滑假丝酵母茵对咪康唑的敏感性较高(58.7％),对伊曲康唑的耐药性较高(62.7％).结论 RVVC中非白假丝酵母茵所占比例高于VVC,光滑假丝酵母菌与白假丝酵母菌对常用的唑类抗真菌药物的药敏情况完全不同.
关键词： 复发性外阴阴道假丝酵母菌病 白假丝酵母茵 光滑假丝酵母菌 药敏试验 -
外阴阴道假丝酵母菌病的诊治
外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)也称外阴阴道念珠菌病,为常见的外阴、阴道炎症.约有10%的非妊娠妇女,30%的妊娠妇女阴道中有假丝酵母菌寄生而无症状.70%妇女一生中至少感染过一次.白色假丝酵母菌(candida albicans)是主要病原体(80%～90%),其他如光滑假丝酵母菌(candida glabrata)、热带假丝酵母菌(candida tropicalis)、近平滑假丝酵母菌(candida parasilosis)等占少数.
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海南岛光滑假丝酵母菌多位点序列分型研究
目的:对海南省光滑假丝酵母菌临床分离株进行基因分型研究,了解菌株的遗传特征及遗传进化关系.方法:采用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)技术,对临床分离的25株光滑假丝酵母菌6个管家基因序列进行测定；并将各个基因的序列与MLST数据库中储存的序列比对,确定其等位基因谱型及菌株序列型(STs).结果:25株临床分离的光滑假丝酵母菌通过MLST产生ST7、ST19、ST15、ST26、ST45共5个不同的序列型,其中ST7为主要序列型.结论:海南省光滑假丝酵母菌感染型别丰富,具有多样性；MLST分型具有较高的分辨力,可用于流行病学和菌群多态性的研究.
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临床分离光滑假丝酵母菌唑类药物耐药机制研究
目的 了解光滑假丝酵母菌临床分离株中唑类耐药株的耐药机制.方法 收集2009年和2010年5家医院28例患者的38株光滑假丝酵母菌,根据CLSI M27-A3指南采用微量肉汤稀释法测定5种常用抗真菌药物(两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑)的小抑菌浓度.采用Real-Time PCR法检测CDR1、CDR2及SNQ2等外排泵基因以及ERG11和转录因子PDR1的表达;流式细胞仪分析罗丹明6G外排能力,考察细胞膜外排泵功能;同时,PCR扩增ERG11基因全长以及PDR1基因主要功能区并测序比对.结果 38株光滑假丝酵母菌对两性霉素B和5-氟胞嘧啶均敏感,其中17株为唑类耐药菌.唑类耐药株CDR1基因表达明显高于敏感株(P =0.001),并且对罗丹明6G外排能力也显著强于敏感菌(P=0.001).光滑假丝酵母菌敏感和耐药菌株ERG11表达差异无统计学意义(P =0.283),且ERG11基因未发现突变.此外,17株光滑耐药菌株PDR1基因表达量与敏感菌株比较差异无统计学意义(P =0.086),但每株耐药菌株PDR1基因均分别发现1处有义突变.结论 转录因子PDR1突变、外排泵基因CDR1表达上调以及外排泵功能增强是目前临床上光滑假丝酵母菌唑类药物耐药的主要机制.
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光滑假丝酵母菌氟康唑耐药机制研究
目的 探讨光滑假丝酵母菌CDR1、CDR2、SNQ2和ERG11基因mRNA表达差异以及ERG11基因突变在氟康唑耐约形成中的作用.方法 采用罗丹明6G试验比较氟康唑耐药组与敏感组的外排泵作用,Real-Time PCR检测外排相关基因CDR1、CDR2、SNQ2和ERG11表达情况.同时,对ERG11基因进行PCR扩增和测序,比较耐药组和敏感组的突变位点.结果 耐药组光滑假丝酵母菌外排泵功能明显强于敏感组,差异有统计学意义(P＜0.01).耐药组的CDR1和CDR2 mRNA表达水平显著高于敏感组(P＜0.01,P＜0.05);但两组间SNQ2和ERG11 mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P＞0.05).检测到ERG11基因4个突变位点,均为同义突变,其中3个突变位点在耐药组和敏感组中均出现,1个突变位点只在敏感组中出现.结论 外排泵功能在光滑假丝酵母菌氟康唑耐药过程中起重要作用.ERG11基因序列存在多态性,但未发现与氟康唑耐药相关的突变位点.
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REP-PCR技术在光滑假丝酵母菌基因分型中的应用价值
目的 评估重复序列PCR (REP-PCR)技术在光滑假丝酵母菌基因分型中的作用.方法 收集深部真菌感染患者体内分离的光滑假丝酵母菌34株,以API 20C AUX酵母菌鉴定板条鉴定菌种及生化表型.采用REP-PCR对34株光滑假丝酵母菌进行基因分型:提取真菌基因组DNA,以Care-2重复元件设计引物,PCR扩增产物电泳后运用NTSYS软件进行聚类分析,聚类树状图相似系数(SI)≥97％且无明显条带差异定为同一基因型,SI≥97％且仅相差一条条带定为亚型.比较REP-PCR分型与多位点序列分型(MLST)的辨别力指数(DP),分析具有不同生化表型光滑假丝酵母菌的REP-PCR基因分型情况.结果 REP-PCR基因分型结果显示:34株光滑假丝酵母菌分为17个基因型,其中A型8株,B型6株,C、D型各3株,E型2株,F～Q型各1株,未发现亚型.REP-PCR和MLST基因分型的DP (95％ CI)分别为0.911(0.770～0.980)和0.369(0.220～0.560),两者比较差异有统计学意义(x2 =21.68,P＜0.01).34株光滑假丝酵母菌有两种生化表型,生化表型代码分别为2000040(32株)和6000040(2株),生化表型代码为60000402的2株经REP-PCR分型结果分别为D型和K型(SI =0.43).结论 REP-PCR对光滑假丝酵母菌基因分型的辨别力较强且操作简便,适用于临床实验室对光滑假丝酵母菌的流行病学研究.
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COPD患者机械通气后下呼吸道真菌感染30例临床分析
目的 探讨COPD患者机构通气后并发下呼吸道真菌感染的特点及防治对策.方法 回顾性分析本院2003年1月～2006年1月30例COPD患者机械通气后并发下呼吸道真菌感染患者的临床资料.结果 30例患者临床表现均无特异性,呼吸道分泌物培养确诊,共培养出真菌32株,包括白色念珠菌20株,热带念珠菌8株,光滑假丝酵母菌4株,对抗真菌药物均敏感,氟康唑治疗有效率89%. 结论 COPD患者长期机械通气治疗并发下呼吸道真菌感染率高,念珠菌属是主要致病菌,氟康唑治疗效果好.
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显色培养基结合厚壁孢子实验的应用价值
目的旨在辅以厚壁孢子形成实验完善显色培养基的菌株鉴别.方法用显色培养基对临床分离的假丝酵母菌进行初步分型,对初分出的光滑假丝酵母菌用厚壁孢子形成实验和ATB-express鉴别系统进行验证.结果显色培养基所分得的13株光滑假丝酵母菌中,有3株在显色培养基上的菌落颜色发生了改变,并且有菌丝和厚壁孢子形成;经ATB-express鉴别系统验证为中间假丝酵母菌,余下的10株为光滑假丝酵母菌.结论显色培养基结合厚壁孢子形成实验可以提高对光滑假丝酵母菌鉴别的符合率,并同时鉴别出中间假丝酵母菌.
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铜绿假单胞菌代谢产物体外对白假丝酵母菌等的抑菌活性研究
目的 观察铜绿假单胞菌代谢产物对假丝酵母菌属的体外抑菌活性.方法 用交叉条带实验方法测定铜绿假单胞菌对54株假丝酵母菌属的体外抑制活性.结果 铜绿假单胞菌产生的抗菌物质对白假丝酵母菌及光滑假丝酵母菌的抑菌作用强,抑菌带宽.产蓝绿色素的第6株铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌和热带假丝酵母菌的抑制率均达100%,产黄绿色素的第8株铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌和克柔假丝酵母菌的抑制率也均达100%,铜绿假单胞菌产色素菌株的抗真菌活性优于不产色素的菌株.结论 铜绿假单胞菌产生的抗菌物质对白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌具有较强的抗真菌活性.
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光滑假丝酵母菌ITSⅠ区PCR-SSCP分子流行病学分析
目的 建立基于聚合酶链反应的单链构象多态性分析(PCR-KSCP)技术,对引起常见医院感染的光滑假丝酵母菌进行基囚多态性分析,并探讨改善其灵敏度和分辨率的优化条件.方法 采用PCR-SSCP技术对临床分离的19株光滑假丝酵母菌以及1株标准株ATCC 90030的rDNA的ITSⅠ区(引物ITS1/ITS2)和ITSⅡ区(引物ITS3/ITS4)多态性进行分析,并对PCR-SSCP的条件进行优化.结果 ITS Ⅰ区较ITS Ⅱ区保守性低,变异性较强,较为适合SSCP分型.针对ITSⅠ区,SSCP电泳在无甘油时,4℃和15℃均将菌株分为6型,但各型所含菌株不同;存在5%甘油时,SSCP电泳分辨率明显增高.结论 在15℃及5%甘油存在的条件下,针对ITS Ⅰ区的PCR-SSCP分型是一种快速、简便的适合于致医院感染光滑假丝酵母菌分型的新流行病学研究手段.
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G试验在ICU侵袭性肺部真菌感染检测中的作用
目的：探讨G试验对侵袭性肺部真菌感染（ invasive pulmonary fungal infection，IPFI）的临床诊断价值及与传统真菌培养之间的关系。方法：应用MB－80微生物动态快速检测系统及GKT－5MSet动态真菌检测试剂盒，定量检测血浆中（1－3）－β－D葡聚糖的含量，并与真菌培养结果进行比较。结果：50例患者中，35例患者真菌培养阳性，其中白色念珠菌18例，热带念珠菌6例，克柔念珠菌6例，光滑假丝酵母菌3例，近平滑假丝酵母菌2例。 G试验含量增高者13例，占总数的26％，G试验含量正常37例，占总数的74％。 G试验含量增高组真菌培养阳性13例， G试验含量正常组真菌培养阳性22例，G试验含量增高组真菌培养阳性率显著高于G试验含量正常组（ P＜0．05）。以真菌培养为标准，G试验的敏感度为37．14％，特异度100％，阳性预测值为100％，阴性预测值为40．5％。结论：G试验较传统的真菌培养法特异性强，可作为侵袭性肺部真菌感染的辅助诊断。
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多位点分型技术在光滑假丝酵母菌基因分型中的应用
目的 通过对海口市光滑假丝酵母菌进行多位点序列分析,了解目前海口市光滑假丝酵母茵感染的主要型别及菌株的遗传特征.方法 对临床收集的37株光滑假丝酵母菌采用多住点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)技术进行测定;并将6个管家基因片段测序后与MLST数据库中已有的序列进行比对,得到等位基因谱,从而得到菌株序列型(sequence type,ST).结果 37株临床分离的光滑假丝酵母菌通过MLST产生4个不同的序列型,分别为ST7、ST19、ST26、ST22,其中ST7型的分离率高.结论 海口市及周边地区临床光滑假丝酵母菌感染以ST7型为主;MLST分型技术分辨力高,可用于流行病学调查和菌群多态性研究.
